Automated genome editing of induced pluripotent stem cells using the CRISPR/Cas9 method

The discovery of the CRISPR/Cas9 system in 2012 has opened up new possibilities for targeted, inexpensive, and reproducible genetic modification of human cells. One of these possibilities is the targeted modification of induced pluripotent stem cells (iPS) for research into hereditary diseases such as Alzheimer's. Over the last decade, the methods for genetic modification have been continuously optimized, and the genetic changes have become increasingly complex. However, the procedures for modification have remained the same manual process steps that experts must carry out. However, the individual process steps are error-prone and not very reproducible. The growing demand for genetically modified cell material has exhausted manual production capacities. As a result, the first process steps for expanding iPS cells have been automated. The StemCellFactory (SCF) is a fully automated platform that produces quality-assured iPS cells. However, the existing platform technology cannot genetically modify the iPS cells produced.As part of this work, a process for the automated genetic modification of iPS cells is being developed, and the influencing factors are investigated. For this purpose, the existing process instructions (SOPs) are first examined for their automation capability. A suitable SOP is selected and converted into a machine-parameterizable flow chart. The process parameters and consumables described in the manual SOP are examined and optimized using a series of tests to determine whether they can be adapted to the SCF's available consumables and machine parameters. The missing capabilities of the SCF are derived from the results of these test series and closed by selecting and integrating suitable hardware. The flow chart developed was then transferred to the SCF and optimized using a series of tests with the GFPMax fluorescence gene. The optimized machine and process parameters were used to validate the automated genetic modification of iPS cells with five different genes relevant to Alzheimer's research and three different cell lines. The editing rate of the iPS cells was determined as a measure of success for process validation and compared with the editing rate of manual experiments. Finally, an automated procedure for the quality-assured monoclonal expansion of the edited iPS cells was developed to make them available for further research into Alzheimer's disease. This work illustrates the far-reaching possibilities offered by the fully automated genetic modification of iPS cells for research and clinical application. It shows a gradation between the editing rates of standard genes, such as GFPMax, and the integration of complex genes, such as those required for research into Alzheimer's disease. By using a fully automated system such as the StemCellFactory, the reproducibility of the process could be increased.

Mit der Entdeckung des CRISPR/Cas9-Systems im Jahr 2012 haben sich neue Möglichkeiten in der gezielten, günstigen und wiederholbaren genetischen Modifikation von humanen Zellen erschlossen. Eine dieser Möglichkeiten ist die gezielte Modifikation von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) für die Erforschung von Erbkrankheiten wie z.B. Alzheimer. Im Laufe des letzten Jahrzehnts wurden die Methoden für die genetische Modifikation immer weiter optimiert und die genetischen Veränderungen wurden immer komplexer. Die Verfahren für die Modifikation sind dabei aber die gleichen manuellen Prozessschritte geblieben, die von Experten durchgeführt werden müssen. Die einzelnen Prozessschritte sind jedoch fehleranfällig und nur wenig reproduzierbar. Dabei hat der wachsende Bedarf an genetisch modifizierten Zellmaterial die manuellen Produktionskapazitäten bereits jetzt ausgeschöpft. Was dazu geführt hat, dass die ersten Prozessschritte für die Expansion von iPS-Zellen automatisiert worden sind. Die StemCellFactory (SCF) ist eine solche vollautomatisierte Plattform und in der Lage qualitätsgesicherte iPS-Zellen zu produzieren. Die bestehende Plattformtechnologie ist jedoch nicht in der Lage die genetische Modifikation an den produzierten iPS-Zellen vorzunehmen. Im Rahmen dieser Arbeit wird ein Verfahren zur automatisierten genetischen Veränderung von iPS-Zellen entwickelt und die Einflussfaktoren erforscht. Hierzu werden zunächst die bestehenden Verfahrensanweisungen (SOPs) hinsichtlich ihrer Automatisierbarkeit untersucht, eine geeignete SOP ausgewählt und diese in ein maschinenparametrisierbares Flussdiagramm überführt. Die in der manuellen SOP beschriebenen Prozessparameter und Verbrauchsmaterialien werden anhand von Versuchsreihen auf die Anpassbarkeit auf die zur Verfügung stehenden Verbrauchsmaterialien und Maschinenparametern der SCF untersucht und optimiert. Aus den Ergebnissen dieser Versuchsreihen werden die fehlenden Fähigkeiten der SCF abgeleitet und durch die Auswahl und Integration geeigneter Hardware geschlossen. Anschließend wurde das entwickelte Flussdiagramm auf die SCF übertragen und anhand einer Versuchsreihe mit dem Fluoreszenzgen GFPMax optimiert. Die optimierten Maschinen- und Prozessparameter wurden für die Validierung der automatisierten genetischen Modifikation von iPS-Zellen mit fünf verschiedenen für die Alzheimerforschung relevanten Genen und drei verschiedenen Zelllinien genutzt. Die Editierungsrate der iPS-Zellen wurde als Erfolgsmaß für die Prozessvalidierung ermittelt und mit der Editierungsrate von manuellen Versuchen verglichen. Abschließend wurde ein automatisiertes Verfahren für die qualitätsgesicherte monoklonale Expansion der editierten iPS-Zellen entwickelt, um diese für die weitere Forschung an der Alzheimererkrankung zur Verfügung zu stellen. In Summe aller Abschnitte illustriert diese Arbeit damit, welche weitreichenden Möglichkeiten die voll automatisierte genetische Modifikation von iPS-Zellen sowohl für die Forschung als auch für die klinische Anwendung bietet. Dabei zeigt sich eine Abstufung zwischen den Editierungsraten von Standard-Genen, wie dem GFPMax und die Integration von komplexen Genen, wie sie für die Erforschung der Alzheimererkrankung benötigt werden. Durch die Verwendung eines vollautomatisierten Systems wie der StemCellFactory konnte die Reproduzierbarkeit des Prozesses erhöht werden.