Durchflusszytometrie nach dem Prinzip der räumlich modulierten Fluoreszenz

In dieser Arbeit wird ein neues technisches Verfahren der Durchflusszytometrie vorgestellt, bei dem das Fluoreszenzlicht von sich im Durchfluss befindlichen Zellen räumlich moduliert wird (Prinzip der Räumlich Modulierten Fluoreszenz). Die Modulation folgt einer nichtperiodischen binären Sequenz und wird physikalisch entweder durch eine Schattenmaske zwischen der Flusszelle und dem Detektor oder einem pixelierten Detektor realisiert. Im Poiseuillschen Flussprofil nehmen die Zellen in Abhängigkeit ihrer Morphologie einen gewissen Gleichgewichtswert ihrer Geschwindigkeit ein. Dieses Verhalten wird als Segré-Silberberg Effekt bezeichnet und ist ein Schlüsselelement des hier vorgestellten Messverfahrens. Zum optischen Nachweis der Zellen, werden diese entweder selektiv angefärbt oder mit spezifischen, fluoreszierenden Antikörper dekoriert. Aufgrund ihrer Gestalt, Größe und biologischen Beschaffenheit unterscheiden sich die Fluoreszenzsignale verschiedener Zellpopulationen vor allem in ihrer Fluoreszenzintensität. Die Geschwindigkeitsinformation der Zellen ist in der Länge der Modulationssignale enkodiert und kann als Messparameter zusammen mit der Fluoreszenzintensität über geeignete Verfahren der digitalen Signalverarbeitung aus den Rohdaten gewonnen werden. Über die Intensitäts- wie auch Geschwindigkeitsinformation können verschiedene Zellpopulationen schließlich unterschieden werden. Dies stellt einen wesentlichen Unterschied zur konventionellen Durchflusszytometrie dar, bei der ausschließlich Fluoreszenz- und Streusignale genutzt werden. Die hier beschriebene Technik bietet einige Vorteile gegenüber dem konventionellen Ansatz. Durch die räumlich ausgedehnte Detektionszone ist die mechanische Realisierung einerseits unempfindlicher gegenüber äußeren Einflüssen wie Temperaturschwankungen oder Vibrationen. Andererseits kann - vor allem für spezielle Anwendungen - auf teuere Optiken verzichtet werden. Im Rahmen dieser Arbeit werden vor allem die verschiedenen physikalischen Realisierungsmöglichkeiten des Prinzips erarbeitet und neue, besonders leistungsfähige Methoden der digitalen Signalverarbeitung entwickelt. Das Hauptaugenmerk liegt auf der Entwicklung spezieller Pulskompressionsfilter, mit deren Hilfe die gesuchten Messparameterm mit hoher Präzision und maximaler Rauschunterdrückung ermittelt werden können. Dabei wird vor allem auf Verwendbarkeit der digitalen Filter und nachgeschalteter Peak-Detektoren mit Echtzeit-Systemen wie FPGAs geachtet. Für breite Geschwindigkeitsverteilungen und geringe Zellkonzentrationen in der Probe hat sich vor allem das in dieser Arbeit diskutierte 'Balancierte' Filter erwiesen. Für enge Geschwindigkeitsverteilungen und hohe Zellkonzetrationen stellt das in dieser Arbeit entwickelte 'Nebenkeulenoptimierte' Filter die beste Filtermethode dar. Die signaltheoretische Betrachtung des Messprinzips wird im Rahmen dieser Arbeit vor allem aus der RADAR- und Nachrichtentechnik adaptiert und eingehend beschrieben. Ein weiterer Fokus dieser Arbeit liegt auf der Bewertung binärer Modulationssequenzen. Dazu werden sowohl vorhandene Modulationssequenzen aus der RADAR-Technik herangezogen, als auch nach geeigneteren neuen Sequenzen gesucht. Bewertungskritierien werden teilweise aus der Literatur übernommen sowie für den Anwendungsfall teils neu definiert. Im experimentellen Teil der Arbeit wird die Funktionsweise des Prinzips mit den in dieser Arbeit vorgestellten Pulskompressionsfiltern gezeigt. Neben einem Vergleich des Signal-zu-Rausch-Gewinns verschiedener Pulskompressionsfilter wird der Nachweis Brustkrebszellen (MCF-7) demonstriert. Darüber hinaus wird die Funktionsweise des Messprinzips mit einem pixelierten Detektor erstmals nachgewiesen, was eine wesentlich flexiblere und einfachere Signalverarbeitung zur Folge hat. Dies begünstigt beispielsweise den Bau eines miniaturisierten Durchflusszytometers, das auf spezielle Anwendungsfälle hin optimiert ist. Beispiele hierzu wären der Nachweis von Legionellen in Trinkwasser, CD4-Count (HIV Überwachung) oder Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen in Blut.

This work investigates a new technical approach in the field of flow cytometry. The fluorescent light of passing cells in a microfluidic channel is spatially modulated by a slit mask in between the channel and the detector yielding a non-periodic modulation signal for each traversing cell. Aside from a single detector in conjunction with a slit mask, it is demonstrated that pixel array detectors can also be used for implementing a spatial modulation scheme. Within the Poiseuille flow profile of the channel, cells migrate to specific equilibrium positions of their velocities which mainly depend on their size and morphology. This behavior is well known as the Segré-Silberberg effect and is a key technique of the measuring principle discussed within the framework of this thesis. For optical detection, cells are either specifically stained by fluorescent markers or tagged by fluorophore-conjugated antibodies attached to antigens at the cell surface. Due to their morphology, size and biological properties, fluorescent signals from different cell populations are primarily distinguished by their fluorescence intensity. Moreover, the velocity information of individual cells is encoded in the duration of the detected modulation signals. This parameter as well as the intensity information are recovered from raw data by appropriate digital signal processing methods. According to these parameters, different cell types can then be distinguished. Compared to conventional flow cytometry making use of fluorescent light and stray light for cell discrimination, the approach discussed here is fundamentally new and promises certain advantages. On the one hand, a larger detecting zone allows for higher mechanical robustness and less susceptibility to harsh environmental influences such as strong temperature fluctuations. On the other hand, our technique can be optimized for specific applications and relinquishes expensive optical elements. Certain methods for physical realization and implementation are evaluated and efficient digital signal processing methods are developed. A main subject of this thesis is the design of dedicated pulse compression filters enabling access to the detection parameters with maximal precision and maximal signal-to-noise-ratio (SNR) gain. For broad velocity distributions of cells, the 'balanced' filter has shown to be a suitable filter type which is discussed in detail in this work. Narrow velocity distributions are better processed by the so called 'sidelobe optimized' filter which shows much better signal dynamics and lower signal artifacts causing false detections. The underlying signal theory is mainly adapted from communications engineering and the field of RADAR technology and is discussed throughout this work. Focusing on binary modulation sequences, existing codes are evaluated for the principle of spatially modulated emission. Moreover, new criteria for performance rating are developed and new, better suited sequences are identified for our application. In the experimental part of the work, the functionality of the theoretically derived filters is demonstrated in a real application. Besides a benchmark of the SNR gain of different filter types, the detection of breast cancer cells (MCF-7) is demonstrated. Additionally, the principle is realized the first time with a pixel array detector allowing for an easier and much more flexible signal processing. Further application-specific designs aiming for miniaturization towards point-of-care diagnostics could highly benefit from this detection scheme. Examples are detector units for legionella in fresh water, CD-4 count (HIV surveillance) or detectors for circulating tumor cells in blood.