Etablierung eines Pseudomonas aeruginosa Biofilmassays zur Antibiotikawirksamkeitstestung

Die Hauptmortalitätsursache von Mukoviszidosepatienten ist die Abnahme der Lungenfunktion aufgrund von bakteriellen Infektionen, wobei P. aeruginosa den essentiellsten Erreger darstellt. Bei chronischen Infektionen bildet P. aeruginosa in der Lunge Biofilme aus. Biofilme sind eine Gemeinschaft von Mikroorganismen, welche an eine abiotische oder biotische Oberfläche haften und von extrazellulären Komponenten (Polysaccharide, Proteine und DNA) umgeben sind. Dieser Biofilm schützt die Bakterien gegenüber antimikrobiellen Substanzen. Die derzeitigen in vitro Assays beziehen sich auf das Wachstum der Bakterien in planktonischer Form. Dies stellt die Situation in einer chronischen Infektion allerdings nur unzureichend dar, da die Bakterien dort in Biofilmen auftreten. Aus diesem Grund war das Ziel der vorliegenden Bachelorarbeit einen in vitro Biofilm-Assay in der Arbeitsgruppe zu etablieren und dieses mit der traditionellen Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) zu vergleichen. Zudem sollte untersucht werden, ob eine schnellere Bestimmung der Keimvitalität über die Messung der respiratorischen Aktivität (Resazurin-Assay und CTC-Assay) möglich ist. Für den in vitro Biofilm-Assay wurden die Biofilme von den P. aeruginosa Stämmen PAO1 und ATCC 9027 in 96 Well Mikrotiterplatten für 24 Stunden angezogen und nachfolgend für 24 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen von Ceftazidim und Tobramycin behandelt. Anschließend wurden die Biofilme resuspendiert und die Lebendkeimzahl durch einen Verdünnungsausstrich bestimmt und mit dem MHK verglichen. Die Ergebnisse der MHK zeigte deutlich, dass die Bakterien in ihrer planktonischen Form sowohl von Ceftazidim als auch von Tobramycin bereits in niedrigen Konzentrationen in ihrem Wachstum gehemmt werden. Aus dem in vitro Biofilm-Assay ging hervor, dass die Bakterien auch bei sehr hohen Ceftazidimkonzentrationen (10 mg/ml) keinen Verlust der Vitalität aufwiesen. Tobramycin hemmt die in Biofilmen gewachsenen Bakterien erst in deutlich höheren Konzentrationen. Der Vergleich der MHK und des in vitro Biofilm-Assays zeigt, dass unterschiedliche Antibiotikakonzentrationen notwendig sind, um das Wachstum der Bakterien zu hindern. Somit stellt der in vitro Biofilm Assay im Vergleich zur MHK ein prädiktiveres Modell dar, um die Wirksamkeit von Antibiotika in Biofilm-assoziierten Infektionen zu überprüfen. Eine Bewertung der Keimvitalität im Biofilm über die metabolische Aktivität mittels Resazurin und CTC Färbung ist nur bedingt möglich, da die unterschiedlichen Stämme hohe Permeabilitätsunterschiede für die Farbstoffe aufwiesen.

The decline of pulmonary function is the major cause of mortality for patients with cystic fibrosis due to bacteria infections, such as infection with P. aeruginosa. This essential pathogen generates a biofilm in the lungs during chronic infections. Biofilms are associations of microorganisms, which adhere on an abiotic and biotic surface and are enclosed from extracellular components such as polysaccharides, proteins and DNA. This protects the bacteria against antimicrobial substances. Current in-vitro assays showed an insufficient representation of the in-vivo situation, because they refer to bacteria growth in planktonic environment. Therefore, the aim of this bachelorthesis was to establish an in vitro biofilm-assay for testing the efficiency of antibiotics and to compare this assay with the traditional method of minimal inhibitory concentration (MIC). Furthermore, it was to investigate whether it is possible to determine the vitality of the pathogens also by measuring the respiratory activity (Resazurin-Assay und CTC-Assay). P. aeruginosa PAO1 and ATCC 9027 were used for in vitro biofilm-assay, cultivated into 96-well plates for 24 hours and treated with different concentrations of Ceftazidim and Tobramycin for additional 24 hours. Afterwards the biofilm was resuspended and the viable count was determined through a dilution streak and compared with MIC-assay. The results of the MIC-assay demonstrate that the bacteria were inhibited through Ceftazidim and Tobramycin. The in vitro biofilm-assay reflects that the bacteria treated with a high concentration of Ceftazidim (10 mg/ml) indicated a pronounced vitality. Tobramycin inhibited the growth of bacteria in biofilms. However, a higher antibiotic-concentration is required for MIC-assay. The comparison of in vitro biofilm- and MIC-assays demonstrate that higher antibiotic-concentrations are necessary to inhibit the growth of bacteria. Thus the in vitro biofilm-assay is better to verify the efficiency of antibiotics to infections with biofilms. The Resazurin- and CTC-assay is not suitable, because different strains indicated high differences in permeability.