Taraxacum officinale as an expression system for recombinant proteins

The latex from Dandelion, Taraxacum officinale Web., contains mainly four abundant peptides with an apparent molecular mass of 66, 60, 37, 18 kDa. These four peptides were termed major latex protein (MLPs). The identification of the MLPs and cloning of their corresponding genes were undertaken with the objective to isolate useful promoters to drive high level transgene expression in genetically engineered T. officinale plants, which would allow a cost-effective purification of recombinant proteins from latex. After determining the partial amino-acid sequences of the MLP cyanobromide peptide fragments, we reported that three MLPs (MLP66, MLP37 and MLP18) show high sequence homology to plant polyphenol oxidases (PPO). Based on these peptide fragments, an inverse PCR strategy was developed to amplify a unique sequence, encoding the latex PPO. RT-PCR was used to confirm the expression of the latex ppo gene and revealed that two closely related genes encoding a PPO are expressed in the latex. Furthermore, several microscopy techniques were developed to identify and analyse the laticifer organisation in T. officinale. The in vitro data suggested that PPO activity is exclusively responsible for the L-DOPA-oxidation observed in the laticifers and in the latex fractions. In addition, we produced and used polyclonal antibodies against the mature PPO form and against the PPO carboxyl domain to probe protein gel blots of latex and plant tissues from T. officinale. Immuno-blot experiments confirmed that MLP66, MLP37 and MLP18 belong to the same gene products and were generated after catalytic cleavage of a pre-mature PPO precursor (MLP66). The presence of three PPO forms in plant sample and the demonstration of catalytic cleavage of the PPO were shown for the first time in this thesis. The promoter region of the latex ppo gene was isolated by adaptor-anchored PCR and evaluated for high level expression of foreign protein in the latex. In this study, I present the results conducted in transgenic T. officinale and demonstrate that the ppo promoter was functional in the host plant. In transgenic T. officinale plants containing the ppo promoter region fused to the beta-glucuronidase (GUS) gene. GUS activity was restricted to the laticifers. Expression level was 50-fold higher in the laticifers than the expression level conferred by the CaMV 35S promoter in the same tissue. A number of potential cis-regulatory elements were identified in silico and are discussed in view of the GUS expression profiles observed in T. officinale. Finally, the ability of T. officinale to express complex recombinant proteins in the latex was tested by expressing the HIV-specific full length 2G12 antibody. In the present study, we demonstrated the expression and assembly of full-length heavy and light chains to form functional 2G12 antibodies in T. officinale leaves and latex fraction.

Latex von Löwenzahn (Taraxacum officinale Web.,) besteht im Wesentlichen aus vier Peptiden, mit Molekulargewichten von 66, 60, 37 und 18 kDa, die als ""Major Latex Proteins"" (MLPs) bezeichnet werden. Um ein Werkzeug zur spezifischen Expression von Transgenen im Latex von Löwenzahn zu erhalten, sollten die Gene der vier MLPs kloniert und die entsprechenden Promotoren isoliert und charakterisiert werden. Dazu wurden die Aminosäure-Sequenzen der MLPs partiell bestimmt. Die erhaltenen Sequenzen zeigen alle hohe Sequenzhomologien zu pflanzlichen Poly-Phenol-Oxidasen (PPO). Eine ""inverse PCR"" Strategie wurde benutzt um einen größeren Teil des Latex-PPO Gens zu amplifizieren, welcher alle drei bekannten MLP Peptidsequenzen beinhaltet. Durch RT-PCR Experimente konnte gezeigt werden, dass nur zwei, eng verwandte, PPO Gene im Latex von Löwenzahn exprimiert werden. Mit verschiedenen Mikroskopietechniken wurde die Organisation der Laticiferen in Löwenzahn untersucht. Die Ergebnisse dieser in situ Untersuchungen deuten darauf hin, dass die PPO Aktivität ausschließlich für die Oxidation des Substrates L-DOPA, welche man in Laticiferen und Latex beobachten kann, verantwortlich ist. Gegen veschiedene Teile des PPO Proteins wurden polyklonale Antikörper hergestellt und zur Detektion verschiedener PPO Untereinheiten in Löwenzahn Latex und Pflanzenextrakten in Immunoblots benutzt. Diese Experimente zeigten erstmals, dass MLP66, MLP37 and MLP18 zum selben PPO Gen gehören und durch proteolytische Spaltung eines PPO Vorläufermoleküls entstehen (MLP66). Die Promotorregion des Latex-ppo Gens wurde mithilfe einer speziellen PCR Technologie, der ""Adaptor-anchored PCR"" isoliert und zur Expression fremder Proteine im Latex von transgenem Löwenzahn benutzt. Es konnte gezeigt werden, dass der isolierte PPO Promotor in Löwenzahn aktiv ist und seine Expression auf das Latex und die Laticiferen beschränkt ist. Die beobachteten Expressionslevel lagen ca. 50-fach über dem Expressionslevel des CaMV 35S Promotors in diesen Geweben. Abschließend wurde die Möglichkeit der Expression eines komplexeren rekombinanten Proteins, des HIV spezifischen 2G12 Antikörpers, in Latex getestet und gezeigt, dass sowohl in Blättern als auch in Latex von Löwenzahn die leichten und schweren Ketten des 2G12 Antikörpers exprimiert und korrekt zusammengesetzt werden und einen funktionalen 2G12 Antikörper bilden.