Kontrollierbare Aktinpolymerisierung initiiert durch DNA-Nanostrukturen

Aktin ist ein Protein des Zytoskeletts eukaryotischer Zellen. Als verzweigtes, dynamisch-stabiles Netzwerk gibt es diesen eine feste äußere Form und ermöglicht zugleich Zellbewegungen, welche an Wundheilungsprozessen, Immunantworten, etc. beteiligt sind. Die Eigenschaften des Aktins sind auf seine Polymerisierungsdynamik zurückzuführen, mittels der es verzweigte Filamentnetzwerke formen kann. Aufgrund seiner Beteiligung an biologisch-medizinischen Prozessen des Körpers ist die genaue Erforschung des Aktins von Interesse. Einen Forschungsbereich bildet die Kräftemessung von Aktinstrukturen. Für exakte Messungen ist es dabei wichtig zu wissen, aus wie vielen Filamenten eine dieser Strukturen besteht, wie sie ausgerichtet sind, etc. Bisherige Protokolle erlauben zwar die in vitro Polymerisierung von Aktin 13 18 aufgrund der sich bildenden Verzweigungen ist es jedoch nicht möglich, die Filamentanzahl zu bestimmen oder zu kontrollieren. Eine mögliche Umgehung des Problems bieten DNA-Nanosysteme, deren modulare Bauweise die exakte Positionierung einer bestimmten Anzahl von Molekülen erlaubt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit ersten Schritten der Untersuchung, ob die Fixierung von Proteinen, welche die Polymerisierung von Aktin initiieren können, an DNA-Nanosystemen eine unverzweigte, lineare Aktinpolymerisierung erlaubt. Um die angestrebte Aktinpolymerisierung zu realisieren, wurden Oligonukleotide mit Hilfe der Terminalen Transferase (TdT) durch aminmodifizierte dUTP verlängert, über die durch Amin/N-Hydroxysuccinimid-Ester (NHS-Ester) Kopplungen zunächst die Querverbindung N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP) und letztlich Nitrilotriessigsäure (NTA) an die DNA gebunden wurde. NTA ermöglicht über hexahistidin-Tags (His6-Tags) die Bindung von rekombinanten Aktinpolymerisierungs-initiierenden Proteinen. Zur Analyse der Reaktionsschritte wurden Polyacrylamid-Gele (PAGE-Gele) und AFM-Mikroskopie (Rasterkraftmikroskopie) verwendet.