Single photon avalanche diode (SPAD) array detectors for luminescence-based biomedical applications

Single photon avalanche diode (SPAD) array detectors, with their single photon sensitivity and picosecond time resolution, are particularly well suited for detecting the small number of photons produced in a chemiluminescence measurement and for determining fluorescence lifetime, which is typically in the nanosecond range. In this dissertation, the key parameters that SPAD array detectors needs to have in order to be used for luminescence-based biomedical applications were investigated. Two application areas were investigated, one being the detection of pathogens in a compact chemiluminescence-based measurement system and the other being fluorophore differentiation using fluorescence lifetime in a flow cytometry measurement system. Using experimental measurements on two measurement setups developed for this purpose and suitable Monte Carlo simulations enabled the detection of SARS-CoV-2 RNA and ssDNA at different concentrations. It was shown that the detection limit defined as acceptable by the WHO (106 copies/ml) can theoretically be achieved with this setup and a suitable assay of 1.8⋅105 copies/ml. The main factors were also determined to further lower the detection limit. Using the second measurement setup, the next step was to investigate the accuracy and precision of fluorescence lifetime determination and its use for fluorophore differentiation. For this purpose, the relation of the accuracy and precision of the determined fluorescence lifetime to the photon counts and the detection rate were investigated, and the required parameters of the SPAD array detector, such as pixel count and time resolution, were determined. The pile-up effect, which limits measurement duration and decreases with higher pixel number, can be reduced with as few as 30 pixels, so that the fluorescence lifetime can already be determined in microsecond measurement durations. In cases such as pathogen differentiation and characterization, differentiation of a large number of fluorophores in a mixture is necessary. Here, differentiation by fractional contributions using fluorescence lifetimes provides an additional multiplexing factor, when the limit of spectrally differentiable fluorophores is reached.

Single photon avalanche diode (SPAD)-Array-Detektoren mit ihrer Einzelphotonen-Empfindlichkeit und Pikosekunden-Zeitauflösung eignen sich besonders gut für den Nachweis der geringen Photonenanzahl, die bei einer Chemilumineszenzmessung erzeugt werden, sowie für die Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer, die typischerweise im Nanosekundenbereich liegt. In dieser Dissertation wurden die Schlüsselparameter untersucht, die SPAD-Array-Detektoren aufweisen müssen, um für Lumineszenz-basierte biomedizinische Anwendungen eingesetzt werden zu können. Zwei Anwendungsgebiete wurden dabei untersucht, zum einen der Nach-weis von Pathogenen in einem kompakten Chemilumineszenz-basierten Messsystem und zum anderen die Fluorophor-Differenzierung mittels Fluoreszenzlebens-dauer in einem Durchflusszytometrie-Messsystem. Anhand von experimentellen Messungen an zwei zu diesem Zweck entwickelten Messaufbauten und mit Hilfe geeigneter Monte Carlo-Simulationen war es möglich SARS-CoV-2 RNA und ssDNA in verschiedenen Konzentrationen nachzuweisen. Da-bei konnte gezeigt werden, dass die von der WHO als akzeptabel definierte Nachweisgrenze (106 Kopien/ml) mit dem Aufbau und einem geeigneten Assay von 1.8⋅105 Kopien/ml theoretisch erreicht werden kann. Auch wurden die Hauptfaktoren bestimmt, um die Nachweisgrenze weiter zu senken. Mit dem zweiten Messaufbau wurde im nächsten Schritt, die Genauigkeit und Präzision der Fluoreszenz-Lebensdauer-Bestimmung und der Einsatz zur Fluorophor-Differenzierung untersucht. Dazu wurde die Abhängigkeit der Genauigkeit und Präzision der bestimmten Fluoreszenzlebensdauer von der Photonenzahl und der Detektionsrate ermittelt und die erforderlichen Parameter des SPAD-Array-Detektors, wie Pixelzahl und Zeit-auflösung, bestimmt. Der auftretende Pile-Up-Effekt, der die Messdauer begrenzt und mit zunehmender Pixelzahl abnimmt, kann schon mit 30 Pixeln verringert werden, sodass die Fluoreszenzlebensdauer bereits in Mikrosekunden-Messdauern bestimmt werden kann. In Fällen wie beispielsweise der Differenzierung und Charakterisierung von Patho-genen, ist eine Differenzierung einer Vielzahl von Fluorophoren in einem Gemisch Zusammenfassung notwendig. Hierbei bietet die Differenzierung durch fraktionierte Beiträge mittels Fluoreszenzlebensdauer einen zusätzlichen Multiplexfaktor, auch wenn das Limit der spektral differenzierbaren Fluorophoren erreicht ist. Dabei konnte gezeigt wer-den, dass die Anzahl der differenzierbaren Fluorophore hauptsächlich durch die Differenz zwischen den vorliegenden Fluoreszenz-Lebensdauern limitiert ist, die bei zwei Fluorophoren mindestens 0.5 ns betragen muss. Durch den Einsatz künstlicher neuronaler Netze konnte die Genauigkeit und Präzision der ermittelten fraktionellen Beiträge im Vergleich zur üblich verwendeten LS-Fit-Methode weiter erhöht werden. Zur Verifizierung dieser Methode für den Einsatz in der Durchflusszytometrie wurden einzelne fluoreszierende Mikropartikeln trotz eines hohen Hintergrund-Fluoreszenz-Anteils von etwa 50 % bei einer Fluoreszenzlebensdauerdifferenz von 0.7 ns differenziert. Aus diesen Messergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass es theoretisch möglich ist, etwa 5000 Zellen oder Partikel pro Sekunde mit dem hier verwendeten SPAD-Array-Detektor zu differenzieren. Für die beiden untersuchten Anwendungen wurden in dieser Dissertation erfolgreich die Anforderungen an den Messaufbau und den SPAD-Array-Detektor ermittelt, was die Entwicklung von maß-geschneiderten SPAD-Array-Detektoren ermöglicht.