Untersuchungen zur Verwendung verschiedener chromatographischer Methoden in der Herstellung und Analytik biopharmazeutischer Plasmide

Um die strengen Richtlinien für pharmazeutisch einsetzbare Plasmide einhalten zu können bedarf es mehrerer Aufreinigungsschritte. Die chromatographische Aufreinigung spielt dabei eine entscheidende Rolle. Dazu werden bisher hauptsächlich partikuläre Säulen verwendet, die ursprünglich zu Aufreinigung von Proteinen entworfen worden sind. Monolithische Säulen hingegen wurden speziell für die Aufreinigung größerer Biomoleküle, wie z.B. Plasmide, entwickelt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte zunächst eine Methode mit einer monolithischen Säule (CIM® C4 HLD-1-Säule) zur Aufarbeitung eines Plasmids entwickelt werden. Trotz Schwierigkeiten mit der Reproduzierbarkeit der Methode konnte diese erfolgreich entwickelt werden. Bei einer Ausbeute von ungefähr 73 % in der Zielfraktion konnten dort ein Anteil von 99 % scpDNA erreicht werden. Nach Entwicklung dieser Methode wurde vergleichend dieser Aufreinigungsschritt über die monolithische Säule und über die bisher verwendete partikuläre Säule (Phenyl-Sepharose TM 6 FF-Säule) durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die monolithische Säule eine dreifach höhere dynamische Bindungskapazität im Vergleich zur partikulären Säule für das hier verwendete Plasmid aufweist. Die Aufreinigung über die monolithische Säule benötigte lediglich die Hälfte der Zeit im Vergleich zur Aufreinigung über die partikuläre Säule. Dennoch konnte mit der partikulären Säule eine wesentlich höhere Ausbeute (51 %) erreicht werden, auch weil die Aufreinigung über die monolithische Säule eine wesentlich geringere Ausbeute (13 %) lieferte, als zuvor in der Methodenentwicklung (73 %). Zudem konnte gezeigt werden, dass mit der partikulären Säule eine deutlich bessere Endotoxinabtrennung erreicht werden kann. Letztendlich zeigte sich, dass die partikuläre Säule bei diesem Vergleich, hauptsächlich aufgrund der deutlich höheren Ausbeute und besseren Endotoxinabtrennung, für diesen Aufreinigungsschritt besser geeignet ist. Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Etablierung einer neuen Methode zur Plasmidanalytik, welche zwei chromatographische Schritte umfasst (GE Healthcare, 2006). Die Methode konnte erfolgreich etabliert und die analytischen Grenzen der Methode bestimmt werden. Für den ersten Schritt der Analyse (HiTrap TM Sepharose HP-Säule) konnte eine Nachweisgrenze von 0,1 ?g/ml bestimmt werden. Der zweite Schritt (HiTrap TM Plasmid Select Xtra-Säule) zeigte sich mit einer Nachweisgrenze von 0,025 ?g/ml noch sensitiver. Beide analytischen Schritte lieferten zum größten Teil gut reproduzierbare Ergebnisse. Für den ersten Schritt lagen die Standardabweichungen in einem Bereich von ± 0,4 bis ± 5,9 %. Bei dem zweiten Schritt lag die Standardabweichung für die erhaltenen Peakflächenverhältnisse bei 1 %. Die Ergebnisse beider Schritte konnten durch andere etablierten Methoden weitestgehend bestätigt werden. Die Methode konnte anschließend zu Analyse erfolgreich verwendet werden.