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2005
Doctoral Thesis
Title
Eine Untersuchung zur Endozytose in Pflanzenzellen
Other Title
An investigation of endocytosis in plant cells
Abstract
Endozytose ist eine fundamentale Eigenschaft des eukaryontischen Lebens. Im Gegensatz zu tierischen Zellen ist Endocytose weitgehend unbekannt. Neuere Forschungsergebnisse deuten auf eine zentrale Rolle der Endozytose als regulatorischer Mechanismus in Pflanzenmorphogenese und Wachstum hin (Baluska et al., 2003; Geldner et al. 2003). Motiviert durch das wachsende Interesse an pflanzlicher Endozytose beabsichtigte diese Arbeit, Endozytosewege und ihre Regulation in Pflanzenzellen mit unterschiedlichen Ansätzen und Techniken zu erkunden. Dreidimensionale Zeitrafferaufnahmen (4D) wurden zur Untersuchung der Struktur und Dynamik von Pflanzenvakuolen - dem terminalen Kompartiment des Endozytosewegs - und dem Endosomenverkehr in lebenden Tabak BY-2 Zellen genutzt. Die Färbung der Vakuolenmembran und endozytischen Kompartimente wurde durch Internalisierung von membrangebundenen Styryl-Farbstoffen erreicht. 4D Bildgebung der markierten Vakuolenmembran offenbarte eine strukturell komplexe und dynamische Morphologie mit sich bewegenden trans-vacuolären Strängen (TVS) mit Fusions- und Spaltungsvorgängen. Diese Beobachtungen führten zur Beschreibung eines Modells der Stranghomöostase, in welchem Fusion und Spaltung von TVS die Veränderungen in der TVS Anzahl während des Zellzyklusses bewirken. In den TVS wurde endozytotischer Vesikelverkehr gemessen. Membranverkehr und -internalisierung wurden anhand verschiedener GFP Fusionskonstrukte untersucht. AtGPIP1-GFP erlaubte die Visualisierung des sekretorischen Vesikelwegs in Verbindung mit Endozytose und Testen des Effekts von Brefeldin A (BFA) auf beide Pfade in Pflanzenzellen. Doppelmarkierung des sekretorischen und endozytotischen Pfades in derselben Zelle demonstrierte, dass das ""BFA Kompartiment"" eine kompositäre Struktur ist. Die Regulation der Endozytose wurde durch künstliche Rezeptor-Konstrukte aus wild-typ Kaninchen Poly-Ig-Rezeptors (pIgR) und GFP untersucht. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass tierische Endozytosesignale in Pflanzenzellen erkannt werden. Zusätzlich zur signalvermittelten Endozytose der künstlichen Rezeptorproteine sollte auch ein natürlicher Pflanzenrezeptor untersucht werden. Dazu wurde das Ve2 Protein aus der Tomate gewählt und an GFP fusioniert. Die Fusionsproteine waren jedoch auch nach Entfernung eines potentiellen ER Lokalisierungssignals im ER lokalisiert. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde ein Assay zur Quantifizierung von Endozytose entwickelt. Die Assay Ergebnisse mit BFA bestätigten dabei die durch Mikroskopie von transgenen, AtGPIP1-GFP exprimierenden Zellen gewonnenen Ergebnisse und zeigten eine Inhibierung des Recyclings. Der Assay wurde im Weiteren dazu genutzt, Auxine und Inhibitoren des polaren Auxin Transports zu screenen. Der polare Transport Inhibitor TIBA hemmt das Membran-cycling des Auxin Efflux Carriers PIN1 (Geldner er al., 2001). Die Hemmung der Membran-Internalisierung durch TIBA konnte mit dem Uptake Assay bestätigt werden. Auxine zeigten in dem Assay einen umkehrenden Effekt auf die Endozytose. In niedrigen Konzentrationen scheinen Auxine die Membranaufnahme zu begünstigen während hohe Konzentrationen die Internalisierung hemmen. Zusammen genommen mit der Erkenntnis, dass die Hemmung des Membran-cyclings von PIN1 zur Blockade des Auxintransports führt, deuten diese Ergebnisse auf einen Auxin Signalpfad hin. In diesem regulieren Auxine ihren eigenen Transport innerhalb der Pflanze durch Endozytose-vermittelte Modulation der Aktivität von Zelloberflächen-Proteinen über deren Konzentration an der Plasmamembran.
Thesis Note
Aachen, TH, Diss., 2005
Publishing Place
Aachen