Lokale Laserfunktionalisierung mit Biomolekülen zur Herstellung von Konzentrationsgradienten

Der Einsatz von UV-Laserstrahlung zur Aktivierung von PMMA wurde für technische Anwendungen bereits 1986 von Srinivasan et al. untersucht. Die nasschemische Funktionalisierung von PCL zur Entwicklung von Implantatoberflächen gehört zum Stand der Technik. Gegenstand dieser Arbeit ist, die Polymeroberflächen von PMMA und PCL mit Excimer-Laserstrahlung der Wellenlängen 193 nm und 248 nm zu aktivieren und diese anschließend nasschemisch mit bioaktiven Molekülen zu funktionalisieren. Es werden Prozessparameter (Fluenz, Pulszahl und Repetitionsrate) bestimmt und deren Einfluss auf die Aktivierung untersucht, die gleichzeitig eine intensive und zerstörungsfreie Aktivierung der Oberflächen erlauben. Die gute Kontrollierbarkeit der Laserbestrahlung und deren räumliche und zeitliche Auflösung lassen erwarten, dass sich die unterschiedlichsten Aktivierungsmuster realisieren lassen, um die Dichte funktioneller Gruppen auf den Polymeroberflächen zu steuern. Neben diskreten homogenen Strukturen werden Konzentrationsgradienten aus Peptiden hergestellt, mit denen die Zellproliferation beeinflusst werden kann. Dazu wird zum einen das Peptid RGD als Zellerkennungssequenz und zum anderen Laktose als Modellmolekül für Glykoproteine an die Oberflächen gebunden. Um eine hohe Intensität der Aktivierung zu erreichen und die Zerstörung der Oberfläche zu vermeiden, wird für beide Wellenlängen und Materialien die Abtragsschwelle sowie das Prozessfenster zur Aktivierung bestimmt. Zunächst muss die Fluenz einen Schwellwert überschreiten damit eine messbare Aktivierung der Oberfläche erfolgt. Die Erhöhung der Bestrahlungsdosis führt zu einer größeren Anzahl aktivierter Gruppen und dadurch zu einer höheren Funktionalisierungsdichte, bis es zur Zerstörung der Oberfläche kommt. Bei Aktivierung der PMMA und PCL Oberflächen entstehen aufgrund der unterschiedlichen Molekülstrukturen unterschiedliche Produkte. Während bei PMMA überwiegend MMA abgespalten wird, brechen bei PCL die Ketten lokal auf, bleiben aber miteinander verbunden. So vergrößert sich die Polymeroberfläche, und eine größere Anzahl aktiver Gruppen entsteht. Bei PMMA dagegen nimmt die Größe der Oberfläche nicht zu, wodurch ab einer gewissen Schwelle keine weiteren funktionellen Gruppen entstehen. Durch Bestrahlung mit der Wellenlänge 193 nm entstehen bis zu zehnmal mehr aktive Gruppen. Diese können in einem nachfolgenden Schritt aminiert werden. XPS-Untersuchungen und Waschexperimente zeigen, das Amingruppen an Proben, die mit 193 nm aktiviert werden kovalent gebunden sind und für die weitere Funktionalisierung zur Verfügung stehen. An Proben mit 248 nm-Aktivierung ist ein Großteil der Amingruppen nicht kovalent gebunden. In diesem Fall wird für eine weitere Funktionalisierung mit bioaktiven Molekülen eine Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS, pH=7,4) zum Waschen verwendet, damit Proteine an der Oberfläche adsorbieren.Durch die Bestrahlung mit 193 nm-Strahlung entstehen an PMMA und PCL hauptsächlich Carboxylgruppen. Aufgrund der geringen optischen Eindringtiefe in PMMA und PCL ist der thermische Einfluss gering. Für 248 nm-Strahlung liegt die optische Eindringtiefe in PMMA bei 0,96 µm und ist fünfmal so groß wie für 193 nm-Strahlung. Der thermische Einfluss auf die PMMA Oberflächen bewirkt, dass neben Carboxylgruppen auch CO2-Gruppen an der Oberfläche entstehen. Dadurch ist die Aktivierung unspezifischer. Für PCL liegt die optische Eindringtiefe bei 25 µm. Der Prozess mit dem die Polymerspaltung erfolgt ist derzeit unklar. Möglicherweise führt die eingebrachte Energie zu thermischen Effekten, so dass das PCL schmilzt oder kumulierte photochemische Effekte auftreten.Die aktivierten Oberflächen können zur Funktionalisierung mit bioaktiven Gruppen verwendet werden. RGD und Laktose binden an die Amingruppen. Zellbesiedlungsversuche zeigen, dass Zellen die unterschiedlichen Regionen der Funktionalisierungsdichte erkennen. Die Bestrahlung stellt also ein wirksames Verfahren dar, welches zu Herstellung von Oberflächen mit unterschiedlicher Funktionalisierungsdichte eingesetzt werden kann. Es erlaubt unterschiedliche Proteinkonzentrationen an die verschiedenen Polymeroberflächen zu binden. Herkömmliche Verfahren arbeiten bei der Bildung von Konzentrationsgradienten durch Bestrahlung mit starren Masken die eine Geometrie vorgeben. Sie sind an feste lineare Geometrie gebunden. Im hier untersuchten Verfahren kann die Probe oder der Laserstrahl frei bewegt werden. So können lineare Strukturen, Punkte unterschiedlicher Funktionalisierungsdichte oder andere freie Geometrien auf kleinstem Raum strukturiert werden. Dies erlaubt den Aufbau miniaturisierter Testsysteme, die die Testung eines Wirkstoffs in beliebig vielen Konzentrationen erlauben. Freie Geometrien werden benötigt, wenn Implantatmaterial lokal aktiviert werden soll, damit sie entweder zellabweisend oder zellwachstumsfördernd wirken. Auch können Wirkstoffe wie Medikamente in definierten Konzentrationen angebunden werden. Die Untersuchung ergibt, dass Proteine und Zuckermoleküle, hier Laktose, an die Oberflächen gebunden werden können. Die Herstellung von Oberflächen mit kontrollierter Funktionalisierungsdichte ermöglicht die Untersuchung von konzentrationsabhängigen Bindungseigenschaften von Zuckern, respektive Glykoproteinen. Dies eröffnet die Möglichkeit, in Zukunft mit neuen Testsystemen neue molekulare Merkmale auf Zuckerbasis zu entdecken, welche der Erkennung von Krankheiten dienen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, dass die kontrollierte Aktivierung von PCL und PMMA mit UV-Excimerlaserstrahlung ermöglicht. Die Weiterentwicklung dieses Verfahrens, mit Hinblick auf einen deutlich reduzierten apparativen Aufwand, durch kleinere UV-Laserstrahlquellen wie Mikrochiplasern wird zur Entwicklung eines neuartigen Aktivierungsverfahrens für die Entwicklung konzentrationsabhängiger Hochdurchsatzverfahren führen.