Artifizielle DNA - bindende Proteine

Etablierte Methoden der molekularen Diagnostik für die Detektion oder Anreicherung von Nukleinsäuren basieren für gewöhnlich auf der Hybridisierung von komplementären Einzelsträngen. Dennoch ist eine Denaturierung des Doppelstrangs nicht zwingend erforderlich, um die Sequenzinformation in einem definierten Abschnitt zu lesen. DNA-bindende - oder modulierende Proteine, wie Transkriptionsfaktoren bzw. Topoisomerasen, interagieren spezifisch mit den Basen des Doppelstranges über exponierte Aminosäureseitenketten, welche naturgemäß durch charakteristische Sekundärstrukturen repräsentiert werden. Die vorliegende Arbeit bietet zunächst einen Einblick in die strukturellen Grundlagen von DNA-Protein-Interaktionen, welche anhand von Cys2His2 - Zinkfinger (ZF) der Sp-Familie und derDNA-bindenden Domäne der E. coli DNA-Gyrase als konkrete Beispiele vertieft werden. Im Anschluss werden die Möglichkeiten der direkten Detektion von DNA für den Einsatz in der molekularen Diagnostik vorgestellt. Ein weiterer Schwerpunkt der Einführung thematisiert gängige Immobilisierungsstrategien für Proteine im Kontext der Generierung von biohybriden Systemen, welche in der modernen Nukleinsäureanalytik und Diagnostik immer mehr an Bedeutung gewinnen. Aufgrund der noch sehr übersichtlichen proteinbasierten, nicht enzymatischen Detektionsmöglichkeiten für Nukleinsäuren wurden im Rahmen dieser Arbeit artifizielle Proteine entworfen, kloniert und in gebräuchlichen Expressionssystemen hergestellt. Im Anschluss an die Aufreinigung sollten Funktionalität nachgewiesen werden sowie einfache Detektionsassays entwickelt werden. Der methodische Teil gibt Aufschluss über die experimentelle Vorgehensweise zur Gewinnung und Charakterisierung von artifiziellen Proteinen, sowie die verwendeten Materialien oder Chemikalien, die zu den im Anschluss vorgestellten Ergebnissen führten. Der Ergebnisteil beginnt mit der Vorstellung der entwickelten Klonierungsstrategien gefolgt von den Expressionsdaten der artifiziellen DNA-bindenden Proteine im eukaryotischen System HEK293, sowie dem prokaryotischen Expressionssystem E. coli BL21(DE3). Der überraschende destabilisierende Effekt der Sp3-ZFD in HEK293 wird dann proteinbiochemisch und zellbiologisch näher untersucht. Die Ergebnisse der Analysendeuten auf eine posttranslationale Degradierung durch das 26S-Proteasom des Fusionsproteins hin. Im weiteren Verlauf werden die Aufreinigungsergebnisse der MBP-Fusionsproteine über Affinitätschromatographie aus E. coli dargelegt. Mit diesen Proteinen wurden dann Immobilisierungsexperimente zur Generierung von Proteinarrays zur Detektion von dsDNA durchgeführt. Die Immobilisierung erfolgte auf Glas, Polysterol sowie auf magnetischen Nanopartikeln. Mit den generierten Arrays wurden kurze (50 bp) lange Oligonukleotide und PCR-Produkte detektiert. Im letzten Teil der Ergebnisse wird über die Entwicklungsschritte eines neuartigen Systems zur präanalytischen Probenaufbereitung mittels gyrA von prokaryotischen Nukleinsäuren berichtet. Durch eine gerichtete Immobilisierungsstrategie von MBP-gyrA konnte erstmals aus einem Gemisch bakterielle von humaner DNA magnetisch separiert werden. Der Diskussionsteil reflektiert kurz die gewonnenen Ergebnisse zu den einzelnen Arbeitspaketen und diskutiert die zellbiologische Signifikanz der proteasomalen Degradierung von EGFP-Sp3. Über dies hinaus werden Vor- und Nachteile der hier entwickelten ZFD-Fusionsproteine in Kombination mit MBP diskutiert. Auch werden in diesem Abschnitt sinnvolle Optimierungen an den bestehenden Systemen aufgezeigt und die Schlussfolgerungen aus dieser Arbeit zu artifiziellen Proteinen in der direkten Detektion von Nukleinsäuren verdeutlicht.