Herstellung und Charakterisierung von rekombinanten Antikörpern und scFv Fusionsproteinen zur Generierung Phytophthora infestans-resistenter Kartoffelpflanzen

Der Kartoffelanbau erstreckt sich weltweit auf einer Fläche von etwa 19 Millionen Hektar und die Kartoffel ist nach Mais, Reis und Weizen die produktionsstärkste Kulturpflanze der Welt. Die weltweit im Kartoffelanbau durch Phytophthora infestans verursachten Schäden sind immens. Ziel dieser Arbeit war P. infestans spezifische Einzelkettenantikörper (scFv - ""single chain fragment variable"") herzustellen, diese genetisch mit antifungalen Peptiden (AFP) zu fusionieren und durch Expression der AFP scFv Fusionsproteine in Kartoffelpflanzen die Widerstandsfähigkeit der Pflanzen gegenüber P. infestans zu erhöhen. Zur Herstellung geeigneter scFvs wurden zwei Strategien verfolgt. Erstens wurden Milzzellen der mit Zellwandfragmenten von P. infestans hyperimmunisierten Mäuse zur Fusion mit Maus Myelomzellen verwendet. Dieser Ansatz resultierte in zwölf P. infestans spezifischen monoklonalen Antikörpern (mAk). Die zweite Strategie beinhaltete die Klonierung von scFv Bibliotheken aus Milzzellen der mit P. infestans Zellwandfragmenten hyperimmunisierten Hühner und Mäuse. Die scFv Bibliotheken wurden zur Selektion P. infestans spezifischer scFvs mittels Phagendisplay verwendet, wobei vier scFvs isoliert werden konnten. Die mAk, von den mAk abgeleitete scFvs und die mittels Phagendisplay selektierten scFvs wurden im Immunoblot analysiert, hinsichtlich ihrer Reaktivität gegenüber P. infestans und Vertretern der Asco-, Basidio- und Oomyceten charakterisiert sowie die Antikörper-Antigen-Bindung mittels Immunofluoreszenzmikroskopie lokalisiert. Der auf dem mAkPi102.2 basierende scFvPi102.2 erwies sich als der zur Zielerreichung geeigneteste Antikörper. Der IgG1 war im Rahmen der getesteten Organismen Oomyceten spezifisch. Sowohl der mAkPi102.2 als auch der scFvPi102.2 zeigten im Vergleich zu den anderen IgG1 und scFvs die höchste Reaktivität gegenüber P. infestans. Das Epitop konnte auf der gesamten Oberfläche von Sporangien, Keimschlauch und Appressorium des intakten Pathogens detektiert werden. Da der mAkPi102.2 alleine keinen inhibitorischen Effekt auf P. infestans ausübte, erfolgte die Fusion des scFvPi102.2 an verschiedene AFP. Die Reaktivität der bakteriell in E. coli und transient in N. tabacum exprimierten AFP-scFv Fusionsproteine gegenüber P. infestans wurde mittels ELISA bestätigt. In einem Testsystem konnte bei transienter Expression der AFP-scFv Fusionsproteine in N. tabacum für zwei Fusionsproteine eine Inhibition von Phytophthora nicotianae auf den transformierten Tabakblättern beobachtet werden. Die Transgene D4E1 scFvPi102.2 und GR7 scFvPi102.2 wurden stabil in das Genom der S. tuberosum Sorten Gala und Pirol integriert. Bei Resistenzuntersuchungen konnten drei transgene Kartoffellinien identifiziert werden, die im Vergleich zum vollständig befallenen Wildtyp zu 100 % befallsfreie Blätter aufwiesen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Entwicklung von AFP scFv Fusionsproteinen und deren Expression in transgenen Kartoffelpflanzen eine vielversprechende Möglichkeit zur Bekämpfung von P. infestans ist.