Monoklonale Antikörper und rekombinante Antikörperfusionsproteine für die Diagnose des Mammakarzinoms und die Therapie des Rhabdomyosarkoms

Monoklonale Antikörper (mAk) und Antikörperfusionsproteine haben einen immer größer werdenden Stellenwert in der pharmazeutischen Industrie. Vor allem in der Diagnose und Behandlung von Krebs finden sie ein breites Anwendungsspektrum. Aufgrund ihrer Spezifität sind sie ideale Moleküle um Wirkstoffe zielgerichtet zum Wirkort zu transportieren oder spezifische Tumormarker zu identifizieren. Die Suche nach neuen tumorassoziierten Molekülen oder Tumormarkern, die mittels Antikörper adressiert werden können, bleibt dabei eine der wichtigsten und schwierigsten Herausforderung. Ziel dieser Arbeit war die Generierung und Charakterisierung mAk gegen ein solches potentielles Tumorantigen. Dieses Antigen RAI3 gehört zur Familie der GPCRs eine der größten und vielfältigsten Rezeptorfamilien überhaupt. Aktuelle Untersuchungen unterstreichen eine besondere Rolle von RAI3 beim Wachstum des Mammakarzinoms und machen es zu einem potentiellen Kandidaten für eine Antikörper-basierte Therapie oder eines diagnostisch relevanten Markers. Die exakte Funktion des Rezeptors ist jedoch bisher nicht genau bekannt und wird kontrovers diskutiert. Mittels Immunisierung von BALB/c Mäusen mit dem Volllängenprotein integriert in Liposomen und klassischer Hybridomatechnologie konnten fünf mAks gegen RAI3 isoliert werden. Diese wurden mittels ELISA, Western Blot und Immunofluoreszenz auf ihre spezifischen Bindungseigenschaften sowohl an gereinigtem Protein als auch an Zellen und Zelllysaten untersucht. Alle untersuchten mAk zeigten eine hohe Spezifität und Affinitäten im nanomolaren Bereich. Eine Bindung der Antikörper an die Zelloberfläche RAI3-positiver Zellen konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Daher wurde eine Untersuchung der Antikörper für die Tumordiagnostik an Tumorgeweben angestrebt. Nach erfolgreicher Etablierung der Immunhistochemie mittels der anti-RAI3 mAk an Paraffin-eingebetteten Gewebeschnitten wurde der mAk 24 2.3 für die Analyse von 147 Mammakarzinom und 44 Mamma-Normalgeweben in einem TMA ausgewählt. Die pathologische Auswertung zeigte eine verbreitete Expression von RAI3 im Tumorgewebe. Allerdings konnte keine Überexpression auf Tumorgewebe im Vergleich zum Normalgewebe und keine Korrelation zwischen der RAI3 Expression und der Prognose basierend auf der Gesamtüberlebenszeit und der Rezidiv-freien Überlebenszeit festgestellt werden. Basierend auf den Ergebnissen dieser ersten veröffentlichen TMA-Studie der RAI3 Expression beim Mammakarzinom bleibt die tatsächliche Signifikanz von RAI3 als Tumormarker uneindeutig. Mittels der hier generierten Antikörper könnte durch weitere Studien ein wichtiger Beitrag zur Aufklärung der Rezeptorfunktion und dessen Bedeutung bei anderen Krebserkrankungen geleistet werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das fAChR-spezifische Immuntoxin, scFv35-ETA' produziert und funktional charakterisiert. Der fAChR ist die fetale Form des nikotinischen AChR und wurde bereits als spezifischer Marker beim RMS identifiziert. Das RMS ist eine seltene Tumorerkrankung des Muskelgewebes und ist die häufigste Weichteiltumorerkrankung bei Kindern. Das beschriebene Immuntoxin besteht aus dem humanen scFv35 basierend auf einem Autoantikörper und einer deletierten Version des ETA'. Dieses Immuntoxin wurde in E.coli erfolgreich exprimiert und aus Zelllysaten gereinigt. Im Anschluss erfolgte die funktionale Charakterisierung hinsichtlich der Spezifität, Affinität und Zytotoxizität. Die Analysen bestätigten eine spezifische Bindung des Immuntoxins mit hoher Affinität (Kd=4,3 nM) auf RMS-Zellinien sowohl des embryonalen als auch des alveolären Subtyps. Im XTT-Proliferationstest konnte die spezifische Inhibition des Zellwachstums fAChR-positiver Zelllinien demonstriert werden, die sich durch Inkubation mit scFv35 ohne toxische Domäne inhibieren ließ. Die verschiedenen Zelllinien zeigten dabei unterschiedliche Sensitivitäten gegenüber dem Immuntoxin mit IC50-Werten zwischen 0,13 nM (FL-OH-1) und 113 nM (RH30). Eine weitere Analyse bezüglich der toxischen Wirkung des Immuntoxins bestätigte weiterhin die Induktion von Apoptose. Das in dieser Arbeit untersuchte Immuntoxin konnte bereits im Rahmen einer Kooperation in einem ersten in vivo Mausmodell untersucht werden, in dem eine deutliche Hemmung des Tumorwachstums beobachtet wurden. Diese vielversprechenden Ergebnisse zeigen das Potential dieses neuen Immuntoxins und machen es zu einem interessanten Kandidaten für die weitere präklinische und klinische Weiterentwicklung. Basierend auf dem humanen scFv35 können durch Fusion mit humanen Toxinen oder anderen Effektormolekülen vollständig humane Immuntoxine entwickelt werden. Auch das Anwendungsfeld fAChR-spezifischer Immuntoxine könnte sich aufgrund neuester Beobachtungen der rhabdoiden Transdifferenzierung von metastatisiertem Melanom zukünftig erweitern.

Monoclonal antibodies (mab) and antibody fusion proteins gain particular significance in pharmaceutical industry with diagnosis and therapy of cancer being the most interesting fields of research and development. Their high specificity make them ideal tools for target directed cancer therapeutics as well as for identification of novel specific tumour markers. The identification and characterisation of new reliable tumour-associated markers remain the most challenging tasks. The aim of this work was the generation and characterisation of mabs against a potential tumour antigen, namely RAI3. RAI3 belongs to the GPCR family the most widespread and abundant receptor family known. Recent studies underline an exceptional role of RAI3 in the growth of mammary carcinoma making it a potential candidate for an antibody-based therapy as well as a novel diagnostic marker. The exact molecular mechanism of RAI3 remains unclear and is a matter of some controversy. In this work we generated five mabs against RAI3 using classical hybridoma technology including immunisation of BALB/c mice with recombinant full-length protein integrated into liposomes. Their specific binding properties on recombinant protein as well as cell lysates and whole cells were characterised using ELISA, Western blot and immunofluorescence techniques. All mabs showed high specificity and affinities against RAI3 in the nanomolar range. However, cell surface binding on RAI3 positive cells in flow cytometry could not be observed. Therefore, further investigations focussed on the application of the antibodies in a diagnostic approach on tumour tissues. A method for staining of paraffin-embedded tissue sections was successfully established. Mab 24 2.3 was subsequently used for the immunohistochemical analysis of 147 breast carcinoma and 44 normal breast tissues using a tissue microarray. We found RAI3 was abundantly expressed in breast carcinoma although median staining score did not differ in normal and tumour tissue. However, there was no association between RAI3 protein expression and prognosis based on overall and recurrence-free survival. Based on these findings, the role of RAI3 as a tumour marker remains unclear. The generated mabs could serve as important tools for further studies on a variety of tissues to reveal the functional role of RAI3 expression in human cancer. In a second part of this work the production and characterisation of a novel fAChR-specific immunotoxin, scFv35-ETA', is described. The fAChR is the fetal precursor of the nicotinic AChR and has already been identified as a specific maker in rhabdomyosarcoma (RMS). RMS is the most common malignant soft tissue tumour of childhood. The investigated immunotoxin is composed of the human autoantibody-based scFv35 and a deletion mutant of Pseudomonas Exotoxin A (ETA'). The immunotoxin was successfully expressed in E.coli and purified from cell lysates following a functional characterisation towards specificity, affinity and cytotoxicity. The analysis confirmed specific binding of the immunotoxin with high functional affinities (Kd= 4.3 nM) on RMS cell lines of the embryonal as well as the alveolar subtype. In an XTT proliferation assay a specific inhibition of cell growth was demonstrated that could be prevented by co-incubation of scFv35 without a toxic domain. A collection of different cell lines were tested that showed varying sensitivities towards the immunotoxins with IC50 values ranging from 0.13 nM (FL-OH-1) to 113 nM (RH30). A further investigation on the cytotoxic potential of the immunotoxins revealed the induction of apoptosis. These promising results show the great potential of this novel immunotoxin making it an interesting candidate for further preclinical and clinical development. The human origin of scFv35 allows the development of a fully human immunotoxin by fusion to human toxins or effector domains. Recent observations of rhabdoid transdifferentiation of metastatic malignant melanoma could reveal a broadened spectrum of application for fAChR-specific therapeutics.