Rupp, SteffenBerg, M.M.Berg2013https://publica.fraunhofer.de/handle/publica/279997Zahlreiche Methoden zur Studie von Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen wurden bereits etabliert. Jedoch fehlt es an Methoden, welche die Wechselwirkungen hoch aufgelöst und zugleich im natürlichen Kontext beschreiben. Eine neue Möglichkeit für die Entwicklung neuer Ansätze bietet der erweiterte genetische Code. Hierbei werden nicht-kanonische Aminosäuren mit neuen physikalisch-chemischen Eigenschaften an definierte Positionen in Proteine in vivo eingebaut. In dieser Arbeit wurden unter Verwendung des erweiterten genetischen Codes und den photoreaktiven nicht-kanonischen Aminosäuren p-Azidophenylalanin sowie p-Benzoyl-phenylalanin Ansätze für die Erforschung von Protein-DNA- und Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo entwickelt. Hierbei wurden beide nicht-kanonischen Aminosäuren positionsspezifisch mithilfe einer orthogonalen tRNA sowie der entsprechenden orthogonalen Aminoacyl-tRNA-Synthetase aus E. coli in die Modellproteine eingebaut. Zugleich wurde auch die Wirkung der orthogonalen Komponenten des erweiterten genetischen Codes auf den hier verwendeten Modellorganismus S. cerevisiae analysiert. Für die Etablierung einer Methode zur Studie von Protein-Protein-Wechselwirkungen wurde das Co-Chaperon Aha1 als Modellprotein verwendet. Dabei wurde eine zuvor in der Literatur beschrieben Bindedomäne zu Hsp90 untersucht. An acht unterschiedliche Positionen in der Bindedomäne wurde p-Azidophenylalanin eingebaut und eine Interaktion dieser mutagenisierten Aha1-Proteine zu Hsp90 mittels einer nativen Co-Immunpräzipitation bestätigt. Anders als ursprünglich erwartet, wurde durch die Belichtung mit UV-Licht jedoch kein Heterodimer bestehend aus Hsp90 und Aha1, sondern ein Homodimer bestehend aus zwei Aha1-Monomeren quervernetzt und massenspektrometrisch identifiziert. Die Ausbildung des quervernetzten Homodimers war nur in Abhängigkeit von UV-Licht, von der genauen Einbauposition der nicht-kanonischen Aminosäure im Protein und der Zugabe der nicht-kanonischen Aminosäure möglich. Dieses Homodimer konnte auch mit einer weiteren photoreaktiven nicht-kanonischen Aminosäure p-Benzoylphenylalanin bestätigt werden. Mit der in dieser Arbeit etablierten Methode konnte eine zuvor in vitro beschriebene Bindedomäne von Aha1 zu Hsp90 nicht bestätigt werden. Stattdessen konnte gezeigt werden, dass diese Bindedomäne bei der Ausbildung von Homodimeren in vivo eine Rolle spielt. Für die Etablierung einer Methode zur Studie von Protein-DNA-Wechselwirkungen wurde der Transkriptionsfaktor Gal4 als Modellprotein verwendet. Gal4 konnte in Abhängigkeit von p-Azidophenylalanin mit der spezifischen GAL7-Promotersequenz quervernetzt und dieser Protein-DNA-Komplex deutlich angereichert werden. Allerdings hat sich Gal4 im Laufe der Experimente als ungeeignet für die Etablierung eines globalen Ansatzes zur Charakterisierung aller Gal4-DNA-Bindestellen herausgestellt, da es bei Überexpression eine toxische Wirkung auf die Zellen zeigte. Zusammengefasst zeigt sich, dass der erweiterte genetische Code einen vielversprechenden Ansatz bietet, um Protein-Protein aber auch Protein-DNA-Wechselwirkungen in vivo zu studieren.de660610620doctoral thesis