Under CopyrightEmmendörffer, AndreasMüller, WalterWeigt, HenningHenningWeigt2022-03-0715.4.20162003https://publica.fraunhofer.de/handle/publica/28078710.24406/publica-fhg-280787It was the aim of this study to analyze the influence of dendritic cells (DC) on the allergic TH2−reaction. Therefore, the generation of human DC from monocytes wasinitially established and optimized. Monocytes were isolated to high purity (97%) bydensity gradient centrifugation and subsequent magnetic cell sorting (MACS) fromthe blood of healthy donors. During a 7−day cell culture period, monocytes developedto immature DC by adding 800 U/ml GM−CSF and 500 U/ml. These werecharacterized by a high endocytotic capacity and a weak expression of CD 80 andCD86 as well as a lack of CD 83.This protocol was used to generate DC from donors allergic to the major allergen ofthe house dust mite Dermatophagoides pteronyssinus (DerP1) and respectively fromnon−allergic control subjects. For functional characterization, these cells wereincubated with autologous lymphocytes. In this in vitro allergy model, a TH2 responsedeveloped in the allergics−group after prestimulation with DerP1. It was characterizedby an enhanced production of the TH2−cytokine IL−4 and a reduced production of theTH1−cytokine IFN−g by the lymphocytes. Allergen stimulation had no effect on thehealthy control group. This model is suited to examine the effect of drug candidateson the potential of DC to modulate lymphocyte function.DC were stimulated with 100 pg/ml of the drug candidate MALP−2, a syntheticlipopeptide derived from Mycoplasma fermentans, and with 500 U/ml IFN−g as wellas the allergen. Stimulation induced the maturation of DC: expression of CD 40, CD80, CD 83 , CD 86 and HLA−DR was upregulated, while the monocyte marker CD 14was downregulated. Furthermore, addition of both substances induced the release ofthe cytokines IL−12and TNF−a. In the coculture of DC and autologous lymphocytes,the allergen specific TH2 reaction was modulated towards TH1 by the stimulation:while the IFN−g release was massively increased, IL−4 production was reduced.Furthermore, MALP−2 and IFN−g plus DerP1 prestimulated DC induced lymphocyteproliferation.These effects depended on the production of IL−12, as inhibiting this cytokine in thecoculture with an antibody reduced IFN−g production and proliferation.The here described modulation of an allergic TH2−reaction to TH1 by MALP−2 andIFN−g treated DC gives a rationale for applying DC in the therapy of allergicdisorders.In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von dendritischen Zellen (DC) auf die allergische TH2−Reaktion untersucht. Dazu wurde zunächst die Generierung von humanen DC aus Monozyten etabliert und optimiert. Monozyten wurden aus dem Vollblut von freiwilligen gesunden Blutspendern mittels Dichtegradientenzentrifugation und anschließender magnetischer Zellsortierung(MACS) in hoher Reinheit (97%) isoliert. In einer 7−tägigen Zellkulturphase entstanden aus den Monozyten durch die Zugabe von GM−CSF und IL−4 unreife DC. Diese waren durch eine hohe Endozytosefähigkeit und eine schwache Expression von CD 80 und CD 86 sowie ein Fehlen von CD 83 gekennzeichnet. Dieses Protokoll wurde angewendet, um DC von Spendern, die gegen das Majorallergen der Hausstaubmilbe Dermatophagoides pteronyssinus, DerP1,allergisch sind, bzw. von gesunden Kontrollspendern zu generieren. Zur funktionellen Charakterisierung wurden diese DC anschließend mit autologen Lymphozytenkokultiviert. In diesem in vitro Allergiemodell stellte sich nach DerP1 Vorstimulation in der Allergiker−Gruppe eine TH2 Reaktion ein. Diese war durch die gesteigerte Produktion des TH2−Zytokins IL−4 und die reduzierte Produktion des TH1−ZytokinsIFN−g durch die Lymphozyten gekennzeichnet. In der gesunden Kontrollgruppe hatte die Allergenstimulation keinen Effekt. Mit diesem Modell kann die Beeinflussung deslymphozyten−modulatorischen Potenzials von DC durch pharmakologische Kandidatensubstanzen untersucht werden. Als Kandidatensubstanz wurden DC von Allergikern mit 100 pg/ml MALP−2, einemsynthetischen Lipopeptid abgeleitet aus Mycoplasma fermentans, und mit 500 U/mlIFN−g sowie dem Allergen stimuliert. Diese Stimulation induzierte die Reifung von DC: Die Expression von CD 80, CD 83 und CD 86 sowie CD 40 und HLA−DR wurde hochreguliert, der Monozyten−Marker CD 14 herunterreguliert. Des Weiteren induzierte die Gabe beider Substanzen die Ausschüttung der Zytokine IL−12 undTNF−a. In der Kokultur von DC mit autologen Lymphozyten wurde durch diese Behandlung die allergenspezifische TH2−Reaktion in eine TH1−Reaktion überführt: Die IFN−g Ausschüttung wurde massiv gesteigert, was mit der Reduktion der IL−4Konzentration einher ging. Des Weiteren induzierten mit MALP−2 und IFN−g sowie Allergen vorbehandelte DC die lymphozytäre Proliferation. Diese Effekte waren von der Produktion von IL−12 abhängig, da die Blockierung dieses Zytokins in der Kokultur durch Antikörper die lymphozytäre IFN−g Produktion und die Proliferation reduzierte. Die hier beschriebene Modulation der allergischen TH2−Reaktion nach TH1 durchMALP−2 und IFN−g stimulierte DC stellt eine Rationale für die Applikation von DC in der Allergietherapie dar.deallergyDendritic cellsMALP-2610620doctoral thesis