CC BY 4.0Stiefel, JanisJanisStiefel2025-09-182025-09-182023https://publica.fraunhofer.de/handle/publica/496019https://doi.org/10.24406/publica-547010.25358/openscience-876410.24406/publica-5470Cancer metastases descend from proliferative circulating tumor cells (CTCs) which disseminate from the primary tumor via blood and lymph vessels. In the last two decades, CTC analysis from blood samples was established for diagnostic and prognostic purposes and therapy monitoring in the course of liquid biopsy. Nonetheless the small number of CTCs compared to billions of blood cells in a patient sample requires sensitive methods to obtain reproducible tumor cell recovery rates. Against this background, the Fraunhofer Institute for Microengineering and Microsystems has recognized the unmet need of standardized CTC isolation and developed automated microfluidic platforms to enrich, detect and isolate single tumor cells from 7.5 mL whole blood. The aim of this thesis was to realize single cell isolation by means of automated immunomagnetic bead enrichment and antibody-based fluorescence detection in a chip-based microfluidic system and the molecular biological characterization of these cells to assay tumor features from liquid biopsy. Therefore, this work compares manual and automated immunomagnetic enrichment in terms of cell recovery in dependency of cell line and input number, bead characteristics, biofunctionalization protocol and blood cell contamination focusing on head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and metastatic breast cancer. In a prototype enrichment device (IsoMAG), we established an isolation protocol with EpCAM-targeting 1 μm magnetic beads for automated enrichment tested on different epithelial cancer cell lines. White blood cell contamination, usually hampering further downstream analysis of enriched tumor cells, was measured by FACS and minimized to about 1200 cells starting from 7.5 mL blood. In the microfluidic benchtop platform CTCelect, we characterized each process step with two different carcinoma cell lines (MCF-7, SCL-1) demonstrating up to 87 % enrichment, 73 % optical detection and dispensing efficiency. 40 to 56.7 % of cells were recovered after complete isolation from 7.5 mL untreated whole blood. We highlighted the bottlenecks of microfluidic cell isolation in dependency of bead-binding on the cell surface and implemented a gating function for the cytometer subunit to selectively dispense cells instead of autofluorescent objects. In doing so, CTCelect enabled automated dispensing of single circulating tumor cells from HNSCC patient samples, qPCR-based confirmation of tumor-related biomarkers with a simplified one-step protocol and immunostaining using a panel of tumor markers. Additionally, the platform was compared to commercial CTC isolation technologies to highlight advantages and limitations of CTCelect. In conclusion, the achieved findings substantially contribute to the establishment of the platform technology in the applied research field of liquid biopsy.Krebsmetastasen gehen von proliferativen zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) aus, die sich vom Primärtumor über Blut- und Lymphgefäße ausbreiten. In den letzten zwei Jahrzehnten wurde die CTC-Analyse aus Blutproben für diagnostische und prognostische Zwecke sowie zur Therapieüberwachung im Rahmen der Flüssigbiopsie etabliert. Die geringe Anzahl von CTCs im Vergleich zu Milliarden von Blutzellen in einer Patientenprobe erfordert jedoch sensible Methoden, um reproduzierbare Tumorzellgewinnungsraten zu erzielen. Vor diesem Hintergrund hat das Fraunhofer-Institut für Mikrotechnik und Mikrosysteme den dringenden Bedarf an standardisierter CTC-Isolierung erkannt und automatisierte mikrofluidische Plattformen zur Anreicherung, Detektion und Isolierung einzelner Tumorzellen aus 7,5 mL Vollblut entwickelt. Ziel der hier vorgestellten Dissertation war die Realisierung einer Einzelzellisolierung durch eine automatisierte Anreicherung basierend auf immunmagnetischen Partikeln und eine antikörperbasierte Fluoreszenzdetektion in einem Chip-basierten mikrofluidischen System und eine darauffolgende molekularbiologische Charakterisierung dieser Zellen um Tumormerkmale aus Flüssigbiopsien nachzuweisen. Die Arbeit vergleicht daher die manuelle und die automatisierte immunomagnetische Anreicherung hinsichtlich der Zellausbeute in Abhängigkeit von Zelllinie und Inputzahl, Partikeleigenschaften, Biofunktionalisierungsprotokoll und Blutzellkontamination mit Fokus auf Kopf-Hals-Tumoren (HNSCC) und metastasiertem Brustkrebs. In einem Prototyp-Anreicherungsgerät (IsoMAG) wurde ein Isolierungsprotokoll mit effektiven EpCAM-funktionalisierten 1 μm Magnetpartikeln für die automatisierte Anreicherung etabliert, das an verschiedenen epithelialen Krebszelllinien getestet wurde. Die Kontamination mit weißen Blutkörperchen, die eine weitere Analyse der angereicherten Tumorzellen behindert, wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen und auf etwa 1200 Zellen aus 7,5 mL Blut minimiert. In der mikrofluidischen Benchtop-Plattform CTCelect wurde jeder Prozessschritt mit zwei verschiedenen Karzinomzelllinien (MCF-7, SCL-1) charakterisiert und dabei eine Anreicherung von bis zu 87 % und eine optische Detektions- und Dispensiereffizienz von 73 % nachgewiesen. 40 bis 56,7 % der Zellen wurden nach vollständiger Isolierung aus 7,5 mL unbehandeltem Vollblut zurückgewonnen. Ferner wurden die Herausforderungen der mikrofluidischen Zellisolierung in Abhängigkeit von der Bindung der Magnetpartikel an die Zelloberfläche aufgezeigt und eine Gating-Funktion für die Zytometer-Untereinheit implementiert, um selektiv Zellen anstelle von autofluoreszierenden Objekten zu dispensieren. Auf diese Weise ermöglichte CTCelect die automatisierte Dispensierung einzelner zirkulierender Tumorzellen aus HNSCC-Patientenproben, die qPCR-basierte Bestätigung tumor-assoziierter Biomarker mit einem vereinfachten Ein-Schritt-Protokoll und die bildgebende Antikörperfärbung an einem Panel von Tumormarkern. Darüber hinaus wurde die Plattform mit kommerziellen CTC-Isolierungstechnologien verglichen, um die Vor- und Nachteile von CTCelect aufzuzeigen. Zusammengefasst tragen die erzielten Ergebnisse wesentlich zur Etablierung der Plattformtechnologie in der angewandten Forschung im Bereich der Flüssigbiopsie bei.endoctoral thesis