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Establishment of a systematised approach for the development of novel diagnostics and therapeutics in the field of biotechnology

Etablierung eines systematischen Verfahrens zur Entwicklung neuer Diagnostika und Therapeutika im Bereich der Biotechnologie
 
: Schumacher, P.

:
Volltext (PDF; )

Aachen, 2006, III, 123 Bl.
Aachen, TH, Diss., 2006
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-15499
Englisch
Dissertation, Elektronische Publikation
Fraunhofer IME ()

Abstract
Das Ziel des ersten Teils der Arbeit war die Generierung eines Antikörpers gegen Nonylphenol, um diesen später in Biofiltern zur Eliminierung von Nonylphenol aus dem Abwasser einzusetzen. Dazu wurden Mäuse verschiedenen Strategien folgend immunisiert. Hier führte die „High Zone Tolerisation“ zu den besten Nonylphenol-spezifischen Antikörper-Titern im Serum. Anschließend wurden die murinen B-Zellen erfolgreich mit Myelomzellen fusioniert und im Folgenden als Einzelzellen sortiert (FACS). Vier der daraus resultierenden stabilen monoklonalen Zelllinien zeigten spezifische Bindungsaktivität an Nonylphenol im ELISA. Der Antikörper NP78 wurde weiterhin in einem „Ligand fishing“ Versuch mit anschließender GCMS Analyse des Überstandes getestet, wodurch ebenfalls die Nonylphenol-Bindung bewiesen werden konnte. Das Ziel des zweiten Teils war die Etablierung eines Verfahrens zur Generierung von Antikörpern spezifisch für Lungenkrebs- bzw. Pankreaskrebs-Proteine und der anschließenden Identifizierung dieser Proteine. Dieses Verfahren wurde entwickelt um die Basis eines Hochdurchsatz-Verfahrens zur Proteom weiten Produktion monoklonaler Antikörper, mit potentiellem diagnostischem oder therapeutischem Wert, zu bilden. Hierzu wurden Mäuse mit ganzen Zellen, Zelllysaten sowie Gewebelysaten immunisiert. Die Entwicklung des Antigen-spezifischen Serumtiters konnte im ELISA für alle Antigene gezeigt werden. Die murinen B-Zellen wurden mit Sp2/mIL-6 Myelom Zellen fusioniert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Einzelzellablage der Hybridomzellen (FACS) mit anschließender Kultivierung der Einzelzellen mit Wachstumsraten bis zu 40% etabliert werden. So wurden 394 und 340 (F. Kampmeier) Antikörper produzierende Hybridomzellen etabliert. Nur wenige dieser Klone konnten aufgrund von Limitierung der Arbeitskraft, Zeit und Finanzen analysiert werden. Die Antikörperproduktion fand in proteinfreiem Medium statt. In Kombination mit Affinität-Matrix-Beads konnten so aufwendige Aufreinigungsschritte vermieden werden. Die Antikörper wurden zur Immunopräzipitation und anschließender Identifizierung der Antigene mittels Massenspektrometrie genutzt. Die Funktionalität des Verfahrens konnte durch ein Modell-System bewiesen werden, in dem Antikörper bekannter Spezifität und mit dem entsprechenden Antigen versetztes Zelllysat verwendet wurden. Fünf neue Antigene konnten mittels dieser Methode identifiziert werden. Die Ergebnisse bestätigen die Eignung des Verfahrens zur Produktion und Charakterisierung von Antikörpern gegen eine Vielzahl von Antigenen.

: http://publica.fraunhofer.de/dokumente/N-63309.html