Abstract
Die Behandlung von Krebserkrankungen, insbesondere solider Tumore, ist sehr anspruchsvoll und die klassische Chemotherapie wird heutzutage durch Antikörper-basierte Therapien unterstützt. Dazu gehören auch die Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs), welche die Spezifität von monoklonalen Antikörpern mit der hochtoxischen Wirkung von Effektormolekülen, wie beispielsweise Mikrotubuli-Inhibitoren vereinen und von denen zwei zur Behandlung von Krebserkrankungen zugelassen sind. Bis heute werden diese Konjugate jedoch überwiegend durch ungerichtete Kopplungsmethoden mit undefinierter Stöchiometrie hergestellt, so dass effizientere Kopplungsmethoden von größter Bedeutung für die Generierung neuer ADCs sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neuartige Antikörperfragment-basierte Immunkonjugate mittels der SNAP-Tag Technologie hergestellt. Diese Technologie erlaubt eine zielgerichtete Kopplung von Benzylguanin (BG)-modifizierten Wirkstoffmolekülen an die Antikörperfragmente, mit dem Vorteil, dass ein homogenes und definiertes Konjugat entsteht. Das hohe Molekulargewicht von etwa 150 kDa von Volllängen-Ak verringert die Tumorpenetration insbesondere in soliden Tumoren. Daher wurden in dieser Arbeit Antikörperfragmente, wie die „single-chain Fragment variable“ (scFvs) als Antigen-bindende Moleküle eingesetzt, um sowohl die Penetration in soliden Tumoren als auch die pharmakokinetischen Eigenschaften der neuartigen ADCs zu verbessern. Eine Vielzahl der soliden Tumore insbesondere Mammakarzinome zeigen eine Überexpression der Rezeptoren der epidermalen Wachtstumsfaktorfamilie), speziell der Rezeptoren EGFR (epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor 1) und HER2 (humaner epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor 2). Dahingehend wurden neuartige ADCs basierend auf EGFR- und HER2-spezfischen scFv-SNAP-Fusionsproteinen generiert und charakterisiert. Als Unterform eines ADCs wurde ein bereits etabliertes Photoimmunkonjugat, bestehend aus dem EGFR-spezifischen 425(scFv)-SNAP-Fusionsprotein und dem Photosensibilisator Chlorin e6 (Ce6), bezüglich seiner in vivo-Funktionalität in einem Mausmodell evaluiert. Dafür wurde die BG-Modifizierung von Ce6 erfolgreich optimiert, um ausreichende Mengen des Photoimmunkonjugats herstellen zu können. In nachfolgenden Teilexperimenten wurde die Funktionalität des Konjugats in vivo untersucht, neben der Bestimmung des bestmöglichen Bestrahlungszeitpunktes und der optimalen Bestrahlungsdosis wurde auch die optimale Dosis bestimmt. Obwohl 425(scFv)-SNAP-Ce6 mit einem EC50-Wert von 58 nM bei einer Bestrahlungsintensität von 25 J/cm² eine gute Effektivität in vitro zeigte, konnte aufgrund von suboptimalem Tumorwachstum keine signifikante Tumorregression beobachtet und bestimmt werden und der Versuch wurde aus Tierschutzgründen abgebrochenWeiterhin wurde im Hauptteil dieser Arbeit neuartige SNAP-Tag-basierte Wirkstoffkonjugate generiert, welche Mikrotubuli-Inhibitoren als Wirkstoffmoleküle besaßen. Drei verschiedene Mikrotubuli-Inhibitoren, Tubulysin, Nocodazol und Auristatin F, wurden an die EGFR- und/oder HER2-gerichtete scFv-SNAP-Fusionsproteine gekoppelt und das zytotoxische Potenzial der generierten ADCs in vitro analysiert. Im Rahmen dessen wurden acht verschiedene Tubulysin-Konstrukte evaluiert, die sich in Länge und Spaltbarkeit ihrer Linkerstrukturen unterschieden. Die Ergebnisse zeigten, dass die Funktionalität der neuen Tubulysin-basierten ADCs in Abhängigkeit zur Linkerstruktur steht. Die Kopplung von Derivaten mit zu kurzer Linkerstruktur an die scFv-SNAP-Fusionsproteine, unabhängig ob spaltbar oder nicht, resultierte in unspezifischer Toxizität. Nur die Kopplung eines Tubulysin-Derivats, dem TAM816d, welches mit einem PEG10-Linker modifiziert wurde, zeigte mit beiden scFv-SNAP Fusionen spezifische Zytotoxizität sowie Apoptose-Induktion in den Zielzellen im unteren nanomolaren Bereich. Der positive Einfluss eines längeren PEG-Linkers (PEG24) konnte zudem durch Experimente mit einem weiteren Mikrotubuli-Inhibitor, dem Nocodazol, bestätigt werden. Nach der Kopplung an 425(scFv)-SNAP war es möglich die Zielzellen gezielt zu eliminieren. Die Generierung zweier weiterer potenter ADCs, bestehend aus Auristatin F (AURIF) modifiziert mit einem PEG1-Linker und HER2 oder EGFR-spezifischen scFv-SNAP Fusionen, zeigte signifikante zytotoxische und pro-apoptotische Effekte sowie die Induktion des Zellzyklus-Arrests auf ausgewählten soliden Mammakarzinom-Zelllinien. Die Bestimmung der EC50-Werte bestätigte, dass durch die Kopplung des Toxins an die Fusionsproteine die Toxizität des ADCs im Vergleich zu dem freien Toxin unbeeinträchtigt blieb oder sogar verbessert wurde. Für 425(scFv)-SNAP-AURIF konnten EC50-Werte von 3 nM und für αHER2(scFv)-SNAP-AURIF von 0,6 nM ermittelt werden. Neben einer hohen Serumstabilität von bis zu 48 h, welche bedeutend für spätere in vivo-Applikationen ist, konnte zudem eine spezifische ex vivo-Bindung von 425(scFv)-SNAP-AURIF auf EGFR-positiven Brustkrebs-Tumorbiopsien gezeigt werden und somit das vielversprechende Potential der neu entwickelten ADCs herausgestellt werden.

 

Treatment of cancer, especially of solid tumors, is challenging and today classical chemotherapy is often supported by antibody-based therapies. This includes antibody-drug-conjugates (ADCs), which combine the specificity of monoclonal antibodies and high toxic impact of effector molecules, like microtubule disrupting agents. Two of them have been approved for cancer treatment. Until today, ADCs are generated by random conjugation methods that do not allow a defined stoichiometry. Therefore new site-directed conjugation strategies are of high interest for the generation of novel ADCs. Within the scope of this thesis novel antibody fragment-based immunoconjugates were generated using the SNAP-tag technology. This technology permits a site-directed conjugation of benzylguanine (BG) modified effector molecules to antibody fragments, allowing the synthesis of a homogenous and defined conjugate. The high molecular weight of 150 kDa of full-length antibodies reduce the tumor penetration of ADCs especially in solid tumors. Therefore antibody fragments, like single-chain Fragments variable (scFvs), were used as antigen-binding moiety of the novel ADCs, to increase tumor penetration and pharmacokinetics. Several of solid tumors such as mamma carcinoma, showed overexpression of members of the epidermal growth factor receptors family, specifically EGFR (epidermal growth factor receptor 1) and HER2 (human epidermal growth factor receptor 2). Thus, novel ADCs based on EGFR- and HER2-specific scFv-SNAP fusion proteins were generated and characterized. As an ADC subform the before established photo-immunoconjugate, consisting of the EGFR-specific 425(scFv)-SNAP fusion protein and the photosensitizer Chlorin e6 (Ce6), was evaluated regarding its in vivo functionality in a murine model. Therefore the BG modification of Ce6 was successfully optimized to generate a sufficient amount of photo immunoconjugate. In following experiments the in vivo functionality of the conjugate, regarding its best suitable irradiation time point, the optimal irradiation dose and the optimal dose of photo immunoconjugate, was investigated. Although 425(scFv)-SNAP-Ce6 showed an EC50-value of 58 nM in vitro when irradiated with 25 J/cm², no tumor regression could be observed and determined in vivo due to suboptimal tumor growth. Therefore the experiment was aborted in respect of animal welfare. Furthermore novel SNAP-tag based ADCs were generated, conjugated to microtubule disrupting agents. Three different microtubule disrupting agents, tubulysin, nocodazole and auristatin F, were conjugated to the EGFR-specific and/or HER2-specific scFv-SNAP fusion proteins and cytotoxic potential of the novel ADCs was evaluated in vitro. In line with this work eight different tubulysin constructs, which differ in length und cleavability of their linker structure, were also evaluated. The results demonstrated that the functionality of the novel tubulysin-based ADCs depends on the linker structure. The conjugation of tubulysin derivatives with short linker structures to scFv-SNAP fusion proteins resulted in unspecific toxicity, independently if the linker structure was non-cleavable or cleavable. Only the conjugation of one tubulysin derivative, TAM816d, which was modified with a PEG10 linker, showed specific cytotoxicity and induced apoptosis in the lower nanomolar range when conjugated to both scFv-SNAP fusion proteins. The positive influence of a longer PEG-based linker (PEG24) could be verified by performing experiments with another microtubule inhibitor named nocodazole. After conjugation of nocodazole to 425(scFv)-SNAP the directed elimination of target cells could be demonstrated. The generation of two additional potent ADCs, consisting of auristatin F (AURIF) modified with a PEG1 linker and an EGFR- or HER2-specific scFv-SNAP fusion, demonstrated significant cytotoxic and pro-apoptotic effects as well as induction of cell cycle arrest on selected s mamma carcinoma cell lines. The resulting EC50 values verified, that the toxicity of the ADCs in comparison to the free toxin was not impaired or even increased after conjugation of the toxin to the fusion proteins. For 425(scFv)-SNAP-AURIF an EC50 value of 3 nM and for αHER2(scFv)-SNAP-AURIF of 0.6 nM could be determined. Besides high serum stability up to 48 h, which is important for potentially in vivo applications, specific ex vivo binding of 425(scFv)-SNAP-AURIF to EGFR-positive breast cancer tumor biopsies could be demonstrated. With these results the promising potential of the novel employed ADCs could be pointed out.