Options
2005
Doctoral Thesis
Titel
Expression and characterisation of biopharmaceuticals in heterologous expression systems
Alternative
Expression und Charakterisierung von Biopharmazeutika in heterologen Expressionssystemen
Abstract
The production of two complex human proteins, the therapeutically relevant anti-HIV full-size IgG1/kappa antibody, (BY-2)2F5, and a soluble form of the high-affinity receptor for human IgG, Fc-gamma-RI (CD64), were successfully established and optimised for heterologous expression in plants, bacteria and mammalian. The first aim of this thesis was the establishment of a protocol for the expression and purification of the anti-HIV antibody, 2F5, in plant suspension cultures (BY-2). Intact and pure antibody could be purified at levels of 1 mg/L per suspension culture out of 340 g BY-2 pellet. ELISA, EMSA and SPR proved comparable antigen binding capacity of the BY-22F5 antibody to the CHO derived control antibody. Neutralisation assays were performed in Vienna with this purification showing no negative influence of plant derived glycosylation. Initial fermentation experiments have shown that BY-2 cells can be grown without limitations on 100-L scale, but conditions for stable antibody production and downstream processing have to be further investigated. For GMP implementation and expression in large-scale reactors under defined conditions protocols and procedures must be established first. Based on the experience in the 100-L downstream processing, feasible equipment was suggested for a purification procedure of 100-L BY-2 culture in approximately two days in compliance with GMP regulations. The second aim of this thesis was to express Fc-gamma-RI as soluble recombinant protein in an appropriate expression system. Therefore, the extracellular domain of Fc-gamma-RI was generated and cloned into vectors for the expression in E.coli, mammalian and plant cells. All three systems were investigated for their ability to produce functional rsCD64. Highest expression levels were reached in the mammalian expression system yielding 1 mg/L. The expression and purification protocol was optimised and purity as well as integrity of rsCD64 was confirmed. Proof of functionality was confirmed by IgG binding activity in ELISA and SPR studies. Purified rsCD64 was functional as demonstrated by this IgG binding, and the binding characteristic was comparable to that of the original membrane bound receptor. Functional, soluble protein is one of the prerequisites for intensive characterisation of the Fc-gamma-RI. This characterisation, will lead to a better understanding of Fc-gamma-RI functionality and development of new specific Fc-gamma-RI targeted therapeutics.
;
In der vorliegenden Doktorarbeit konnte die Produktion von zwei komplexen humanen Proteinen, dem therapeutisch relevanten anti-HIV IgG1/kappa Volllängenantikörper: (BY-2)2F5, und einer löslichen Form des hochaffinen Rezeptors für humanes IgG: Fc-gamma-RI (CD64), erfolgreich für die heterologe Expression in Pflanzen, Bakterien und Säugerzellen etabliert und optimiert werden. Erstes Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Protokolls für die Expression und Aufreinigung des anti-HIV Antikörpers 2F5 in Pflanzensuspensionskulturen (BY-2). Aus 340g BY-2 Pellet konnte 1mg/L reiner und intakter Antikörper aufgereinigt werden. Im ELISA, EMSA und SPR zeigte diese Präparation vergleichbare Antigenbindungskapazitäten wie der in CHO-Zellen produzierte Kontrollantikörper. Ein negativer Einfluss der pflanzlichen Glykosylierung konnte in Neutralisationsversuchen in Wien ausgeschlossen werden. Fermentationsexperimente konnten zeigen, dass BY-2 Zellen ohne Einschränkung bis in den 100-L Maßstab wachsen, allerdings müssen die Bedingungen für eine stabile Antikörperproduktion und -aufreinigung intensiver untersucht werden. Für eine GMP-Implementierung und eine Expression im Großmaßstab unter definierten Bedingungen müssen zuerst geeignete Protokolle und Abläufe etabliert werden. Basierend auf den Erfahrungen einer 100-L Aufreinigung, konnten Vorschläge für geeignete Geräte gemacht werden, um 100-L BY-2 Kultur in ungefähr 2 Tagen unter GMP-Bedingungen aufzureinigen. Das zweite Ziel dieser Arbeit bestand in der Expression von löslichem Fc-gamma-RI in einem geeigneten Expressionssystem. Dafür wurde die extrazelluläre Domäne von Fc-gamma-RI generiert und in verschiedene Vektoren für die Expression in E.coli, Säuger- und Pflanzenzellen kloniert. Diese drei Systeme wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, funktionales CD64 zu produzieren. Mit 1 mg/l konnten die höchsten Expressionraten in dem Säugerzellsystem erreicht werden. Die entsprechenden Expressions- und Aufreinigungsprotokolle wurden optimiert und sowohl die Reinheit als auch die Integrität des rekombinanten löslichen CD64 (rsCD64) konnte bestätigt werden. Die Funktionalität wurde über die Bindung von humanem IgG in ELISA und SPR Untersuchungen verifiziert. Abschließend konnte man sagen, dass die Funktionalität des rsCD64 vergleichbar war mit der des originalen, membrangebundenen Rezeptors. Funktionelles und lösliches Protein ist eine der Voraussetzungen für eine intensive Charakterisierung von Fc-gamma-RI. Dies wird zu einem besseren Verständnis der Funktion von Fc-gamma-RI führen und die Entwicklung spezifischer Fc-gamma-RI getargeter Therapeutika fördern.
ThesisNote
Aachen, TH, Diss., 2005
Verlagsort
Aachen