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Generierung und Charakterisierung eines immunoaffinitätsbasierten Reinigungssystems für rekombinante Proteine

Generation and characterization of an immunoaffinity based purification system for recombinant proteins
 
: Rasche, S.
: Fischer, R.

:
Volltext (PDF; )

Aachen, 2011, 131 S.
Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2011
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-37672
Deutsch
Dissertation, Elektronische Publikation
Fraunhofer IME ()
Gentechnologie; Antikörper; Produktaufarbeitung

Abstract
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Reinigungs- und Detektionssystems für rekombinante Proteine basierend auf der spezifischen Interaktion zwischen dem Epitoptag 54 und des korrespondierenden monoklonalen Antikörpers 54. Das mAk54/Tag54 System sollte sich gegenüber bereits beschriebenen Systemen durch ein kostengünstiges und robustes Immunosorbens sowie durch die Möglichkeit, die zu reinigenden Proteine unter überwiegend nativen Bedingungen zu eluieren, abheben. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden alle relevanten Parameter analysiert, wobei die Kosten für die Bereitstellung des mAk54 sowie die Notwendigkeit niedrige pH-Werte zur Elution der gebundenen Proteine bei der Immunoaffinitätschromatographie (IAC) einzusetzen, als Hauptschwachpunkte ausgemacht wurden. Um die Bereitstellungskosten des mAk54 zu minimieren, wurde die Kultivierung der mAk54 sezernierenden Zelllinie in zwei Einwegbioreaktorsystemen untersucht, wobei Produktakkumulation, Handhabbarkeit sowie der generelle Kostenaufwand beider Systeme verglichen wurde. Unter optimalen Bedingungen konnte die Menge von 1 g mAk54 für ca. 1280 € innerhalb von 45 Tagen produziert werden. Für die nachfolgende Reinigung des mAk54 wurden die drei Sorbenzien Protein A, Protein G sowie MEP HyperCel verglichen. Die besten Resultate konnten mit dem MEP HyperCel Sorbens erzielt werden, wobei Ausbeuten von >95 % und Reinheiten von >90 % erreicht wurden. Unter Berücksichtigung der Kosten für die Antikörperreinigung betragen die Gesamtbereitstellungskosten für ein Gramm mAk54 ca. 1700 €. Um bei der IAC den Einsatz von mildem Elutionspuffern zu ermöglichen, wurde die Affinität zwischen mAk54 und Tag54 durch gezielte Modifikationen der Tag54 Sequenz reduziert. Dazu wurden via Alaninscan die für die Bindung an den mAk54 essentiellen Aminosäuren innerhalb der Tag54-Sequenz identifiziert (K4A, D5A, W6A) und in anschließenden Experimenten gegen strukturell ähnlich wie auch gegensätzliche Aminosäuren ausgetauscht. Insgesamt wurden zehn rationell designte Tag54 Varianten hergestellt und hinsichtlich der kinetischen Parameter der Interaktion zwischen Tag54 und mAk54 untersucht. Mittels Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie wurde der Einfluss unterschiedlicher Puffer sowie Temperaturen auf die Elutionseffizienz ausgewählter Tag54 Varianten bestimmt. Dabei hat sich die Variante P16 - ein 18 Aminosäuren umfassendes Trimer der sechs Aminosäuren langen Kernepitopsequenz - als besonderes vielversprechend erwiesen. Bei pH 4,0 unter Zusatz von 0,5 M NaCl wurde eine Elutionseffizienz von 70 % ermittelt, während die unmodifizierte Tag Variante unter diesen Bedingungen nur 30 % erzielte. Durch den Einsatz verschiedener Salze konnte die Elutionseffizienz für P16 auf über 90 % gesteigert werden. Zur Herstellung des Immunosorbens wurde der mAk54 ungerichtet an NHS-aktivierte Sepharose gekoppelt, wobei eine Kopplungseffizienz von über 99 % erreicht wurde, die optimale Ligandendichte wurde auf 4 mg mAk54/ml bestimmt. Die spezifische Kapazität des Sorbens bei dieser Ligandendichte beträgt 6 nmol/ml. Zur Charakterisierung des mAk54 Immunoaffinitätssystems wurden die zwei Modellproteine tdTomato und Protein L C-terminal mit der P16 Variante des Tag54 fusioniert und rekombinant in E. coli exprimiert. Beide Proteine konnten mit hoher Reinheit und überwiegend nativ (>80 %) eluiert werden. Neben der Eignung als terminaler Fusionstag wurde zudem untersucht, ob sich der Tag54 als Linker zwischen den variablen Domänen der leichten und schweren Kette von scFv-Antikörpern eignet. Als Modell wurde der gegen das „Grapevine leafroll-associated virus 3“ generierte scFvLR3cp-1 verwendet. Der bestehende Whitlow 218 Linker wurde durch drei Varianten der Tag54 Sequenz ersetzt, nach Expression in E. coli und Reinigung via IMAC und IAC wurden die scFv-Antikörper hinsichtlich Reinheit, der kinetischen Parameter der Interaktion zwischen scFv und Antigen, sowie des Anteils an funktionalem scFv verglichen. Dabei wurde festgestellt, dass die Bindung des scFv an das Antigen GLRaV3-CP durch die Verwendung des Tag54 als Linker nicht beeinträchtigt wird, die Reinheit der via IAC gereinigten scFv war wie bei Protein L-Tag54 und tdTomato-Tag54 sehr hoch, während der mittels IMAC gereinigte scFv deutliche Kontaminationen mit Wirtszellproteinen aufwies. Aktivitätsverluste verursacht durch die IAC konnten nicht beobachtet werden. Das Tag54/mAk54 System konnte somit erfolgreich optimiert und zur Detektion und Reinigung verschiedener Modellproteine eingesetzt werden. Die Reinigungseffizienz war in allen Fällen sehr hoch, die jeweiligen Zielproteine wurden ohne unspezifische Kontamination durch Wirtszellproteine eluiert, die Proteinintegrität und -Aktivität blieben zum größten Teil (> 80 %) erhalten. Das Ziel dieser Arbeit, die Entwicklung eines kostengünstigen und robusten Immunosorbens, das zu Reinigung von Proteinen unter überwiegend nativen Bedingungen eingesetzt werden kann, wurde somit erreicht.

: http://publica.fraunhofer.de/dokumente/N-217313.html