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Characterization of interleukin-6 monoclonal antibodies for future applications

 
: Chouman, K.

:

Aachen, 2018, IX, 105 pp.
Aachen, TH, Diss., 2018
English
Dissertation
Fraunhofer IME ()

Abstract
Interleukin-6 (IL-6) is a cytokine not only involved in inflammation and infection responses but also in the regulation of metabolic, regenerative, and neural processes. Although its expression is strictly controlled by transcriptional and post-transcriptional mechanisms, deregulated continual synthesis of IL-6 plays a pathological role in chronic inflammation and autoimmunity. Strategies targeting IL-6 and IL-6 signalling lead to effective prevention and treatment of models of rheumatoid arthritis and other chronic inflammatory diseases. Screening for high amounts of IL-6 in the patients’ blood serum can be crucial for an adequate treatment. Considering the important role of IL-6, this study started with the production of the human IL-6 cytokine. The characterization of this cytokine was done with eight murine monoclonal antibodies (mAbs), raised against human IL-6 by the Mobiguide group. The recombinant formats were generated from the binding monoclonal antibodies and characterized in parallel. The antibodies were tested for applications in various immunological assays such as ELISA, Western blot, surface plasmon resonance (SPR), flow cytometry analysis and finally cellbased assays for blockage of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) activation. The antibodies derived from hybridoma clones #3 and #4 were also implemented into an amperometric biochip platform, where some tests for the detection of IL-6 in peripherical blood were made. The results of the SPR analysis, ELISA and Western blot demonstrate that the produced IL-6 is functional and correctly folded. The limit of detection was determined by sandwich ELISA (0.5 ng/mL IL-6, SD ±0.013). For epitope analysis by SPR, hIL-6-IME, IL-6 from Conaris and hyper-IL-6 were included, demonstrating clear differences between the antibody clones. IL-6 spiked in full blood samples could be detected by the amperometric platform. Intracellular IL-6 was verified by flow cytometry, showing that the antibody #3 is a suitable antibody for this purpose. The antibodies #3 and #6 could block activation of STAT3 in two different cell lines assay. These findings emphasize the use of the generated mAbs as promising candidates for application in various immunological assays.

 

Interleukin-6 (IL-6) ist ein Zytokin, das nicht nur an Entzündungs- und Infektionsreaktionen, sondern auch an der Regulation metabolischer, regenerativer und neuraler Prozesse beteiligt ist. Obwohl seine Expression streng durch transkriptionelle und posttranskriptionale Mechanismen gesteuert wird, spielt die deregulierte kontinuierliche Synthese von IL-6 eine pathologische Rolle bei chronischen Entzündungen und Autoimmunität. Strategien, die auf IL-6 und IL-6-Signalgebung abzielen, führen zu einer wirksamen Prävention und Behandlung von Modellen der rheumatoiden Arthritis und anderer chronisch-entzündlicher Erkrankungen. Das Überprüfen auf hohe Mengen von IL-6 im Blutserum der Patienten kann für eine adäquate Behandlung entscheidend sein. In Anbetracht der wichtigen Rolle von IL-6 begann diese Studie mit der Produktion des menschlichen IL-6-Zytokins. Die Charakterisierung dieses Zytokins erfolgte mit acht murinen monoklonalen Antikörpern (mAbs), die von der Mobiguide-Gruppe gegen humanes IL-6 erzeugt wurden. Die rekombinanten Formate wurden aus den bindenden monoklonalen Antikörpern generiert und parallel charakterisiert. Die Antikörper wurden auf Anwendungen in verschiedenen immunologischen Assays getestet, wie ELISA, Western Blot, Oberflächenplasmonresonanz (SPR), Durchflusszytometrieanalyse und schließlich auf zellbasierten Assays zur Blockierung des Signaltransduktors und des Aktivators der Transkription 3 (STAT3) -Aktivierung. Die von den Hybridomklonen # 3 und # 4 gewonnen Antikörper wurden zudem in eine amperometrische Biochip-Plattform implementiert, wo einige Tests zum Nachweis von IL-6 im peripheren Blut durchgeführt wurden. Die Ergebnisse der SPR-Analyse, ELISA und Western Blot zeigen, dass das produzierte IL-6 funktional und korrekt gefaltet ist. Die Nachweisgrenze wurde durch Sandwich-ELISA bestimmt (0,5 ng / ml IL-6, SD ± 0,013). Für die Epitopanalyse durch SPR wurden zusätzlich hIL-6-IME, IL-6 von Conaris und Hyper-IL-6 getestet. Hier zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den Antikörperklonen. In Vollblutproben, die mit IL-6 versetzt wurden, konnte das IL-6 durch die amperometrische Plattform nachgewiesen werden. Intrazelluläres IL-6 wurde durch Durchflusszytometrie verifiziert, was zeigt, dass der Antikörper # 3 ein geeigneter Antikörper für diesen Zweck ist. Die Antikörper # 3 und # 6 konnten die Aktivierung von STAT3 in zwei verschiedenen Zelllinien blockieren.

: http://publica.fraunhofer.de/documents/N-569502.html