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Vergleichende Untersuchungen zum toxischen und gentoxischen Potenzial von verschiedenen, oberflächenmodifizierten Kohlenstoffnanoröhren in humanen Lungenfibroblasten

 
: Ehrlich, Tomke
: Scharfenberg, Klaus; Ziemann, Christina

Emden-Leer, 2019, 84 pp.
Emden-Leer, Hochschule, Bachelor Thesis, 2019
German
Bachelor Thesis
Fraunhofer ITEM ()
multi-walled carbon nanotubes; nanotubes - genetoxic effects

Abstract
Kohlenstoffnanoröhren (CNTs) werden vermehrt in verschiedensten Anwendungsfeldern genutzt und somit potenziell ebenso vermehrt freigesetzt. Sie rücken dadurch und wegen der morphologischen Ähnlichkeit zu gesundheitsschädlichem Asbest, als neue Materialien zunehmend in den Fokus der Forschung. Da die Studienlage zu dieser Thematik noch undurchsichtig ist, wurden für diese Arbeit im Rahmen des Projekts „International Collaboration On Nanotube Safety“ (ICONS) verschieden funktionalisierte, mehrwandige Kohlenstoffnanoröhren (MWCNTs) getestet, die aus einer Ausgangscharge der kommerziell erhältlichen Faser NC7000 der Firma Nanocyl (Belgien) synthetisiert worden waren. Die MWCNTs wurden in primären humanen Lungenfibroblasten (MRC-5) als Zellmodell auf ihre klastogene und/oder aneugene Wirkung hin untersucht. Mittels alkalischem Comet Assays wurde die Induktion von DNA-Strangbrüchen (klastogene Wirkung) nach 24-stündiger Inkubation mit 1 µg/cm² der MWCNTs im Vergleich zur Negativkontrolle (NK) und Ethylmethansulfonat (EMS) als methodischer Positivkontrolle untersucht. Weiterhin wurde eine Kombination aus Mikrokerntest und DNA-Fluoreszenzin-situ-Hybridisierung (FISH) mit einer Centromersonde (spezifisch für Chromosom 1, 5, 19) eingesetzt, um Mikrokerne (MN) zu detektieren, die Chromosomen enthielten, damit auf eventuelle aneugene Wirkungen der MWCNTs rückgeschlossen werden konnte. Hierzu wurden die Zellen für 48 Stunden mit je 1 µg/cm² der MWCNTs oder Kulturmedium als NK inkubiert. Behandlungszeitpunkt und -dauer sowie die Behandlungskonzentration wurden auf Basis einer zuvor ermittelten Wachstumskurve und eines Laktatdehydrogenase (LDH)-Tests zur Dosisfindung festgelegt. Sowohl im Rahmen des Comet Assays als auch beim Mikrokerntest wurde parallel ein LDH-Test mitgeführt, um über die Membranintegrität einen Parameter für die Zytotoxizität der MWCNTs zu erhalten. In beiden Versuchen zeigte sich jedoch keine vermehrte LDH-Freisetzung und somit keine Zytotoxizität, sodass, wo nachweisbar, von spezifischen genotoxischen Effekten ausgegangen werden konnte. Während im alkalischen Comet Assay keine klastogene Wirkung durch die MWCNTs nachgewiesen wurde, zeigte sich im FISH-Mikrokerntest, dass die untersuchten MWCNTs in der Lage waren, MN mit Chromosomen zu induzieren, was auf eine aneugene Wirkung der Fasern hindeutete. Bei der Auswertung mit dem automatischen, Mikroskop-basierten Bildanalyse-System Metafer (Firma MetaSystems) konnten jedoch keine markanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Oberflächenfunktionalisierungen bezüglich der Induktion von MN detektiert werden. Aufgrund der geringen Anzahl biologischer Replikate und der noch anstehenden Optimierung des Auswerteverfahrens am Metafer-System sollten die Ergebnisse durch weitere Experimente überprüft werden. Aus den gewonnenen Daten kann gefolgert werden, dass die getesteten MWCNTs in der Behandlungskonzentration von 1 µg/cm² keine klastogenen, jedoch nicht funktionalisierungsspezifische aneugene Effekte in MRC-5 Zellen zeigten.

 

The increasing use of carbon nanotubes (CNTs) in various applications also increases the potential for their emission into the environment. For this reason and due to morphological resemblance to harmful asbestos fibres, CNTs, as a new material, have drawn growing attention in scientific research. According to the inconclusiveness of relevant studies, this bachelor thesis focused on investigation of differently functionalised, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs), which were synthesized from one batch of the commercially available fibre NC7000 from Nanocyl (Belgium). This was done in context of the research project „International Collaboration On Nanotube Safety“ (ICONS). Using human primary lung fibroblasts (MRC-5) as cellular model system, the clastogenic and aneugenic potential of these MWCNTs were tested. After 24 hours of incubation with 1 µg/cm² of the respective MWCNTs or ethyl methanesulfonate (EMS) as methodological positive control in relation to the negative control (NK), the induction of DNA strand breaks was determined using the alkaline comet assay (clastogenic effect). The aneugenic effect was determined by a combination of a micronucleus test and DNA fluorescence in situ hybridisation with a chromosome-specific centromeric probe (specific to chromosomes 1, 5, 19) used for detecting micronuclei (MN) with chromosomes. Therefore, the cells were incubated 48 hours with 1 µg/cm² of the different MWCNTs or culture medium (NK). To determine the treatment time point, treatment duration and treatment concentration, previously a growth curve and a lactate dehydrogenase (LDH) assay for dose finding were performed. Additional LDH assays were done in both the comet assay and the micronucleus test to get a cytotoxicity parameter for MWCNTs by using the integrity of plasma membranes as endpoint. None of the tests showed an increasing release of LDH and thus no cytotoxicity was observed. Therefore, the genotoxic effects if detected, were of genotoxic-specific nature. While the alkaline comet assay demonstrated no clastogenic effects of the tested MWCNTs, chromosome containing MN were observed, indicating an aneugenic effect of the tested fibres. The evaluation done by the automated, microscopebased image analysis system Metafer (by MetaSystems) revealed no substantial difference in the potential of the different surface modifications to induce MN. Due to the small number of biological replicates and the needed improvement and validation of the used classifiers of the Metafer-System, the results should be verified by further experiments. Nevertheless, the generated data indicate no clastogenic, but a functionalisation-independent aneugenic effect of the tested MWCNTs in MRC-5 cells treated with a concentration of 1 µg/cm².

: http://publica.fraunhofer.de/documents/N-569407.html