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Untersuchung von Abwasserproben auf Gentoxizität

Ergebnisse eines Ringversuchs mit dem in vitro-Mikrokerntest im Rahmen der Standardisierung nach ISO
 
: Reifferscheid, G.; Selke, D.-M.; Ziemann, C.; Stopper, H.; Rodrigo, G.; Kunz, S.; Hollert, H.; Hafner, C.; Grummt, H.-J.; Gminski, R.; Fieblinger, D.; Dill, F.

:

Umweltwissenschaften und Schadstoff-Forschung : UWSF. Zeitschrift für Umweltchemie und Ökotoxikologie 19 (2007), No.1, pp.7-16
ISSN: 0934-3504
ISSN: 1865-5084
German
Journal Article
Fraunhofer ITEM ()
chromosomal aberration; collaborative study; genotoxicity; in vitro micronucleus assay; ISO standardisation; V79

Abstract
Background, Aim and Scope:
ZIEL UND HINTERGRUND. Im Zuge der internationalen Standardisierung des in vitro-Mikrokerntests mit V79-Zellen für die Untersuchung und Bewertung von Wasserproben auf Gentoxizität (ISO/DIS 21427-2) wurde unter Federführung der Bundesanstalt für Gewässerkunde (BfG) ein nationaler Ringversuch durchgeführt. Es beteiligten sich 10 Laboratorien aus der freien Wirtschaft, von Hochschulen und Behörden. Beim Mikrokerntest handelt es sich um die Testung auf eine spezielle Form von Chromosomenaberration.
Um die Standardisierung des Verfahrens abschließen zu können, mussten codierte Abwasserproben in Form eines Ringtests untersucht werden. Es sollten damit die Durchführbarkeit des Verfahrens dokumentiert und Validitätsdaten erhoben werden.
Materials and Methods:
MATERIAL UND METHODEN. Der Mikrokerntest wurde mit V79-Zellen, einer permanent wachsenden Zelllinie von Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters durchgeführt. Es wurden vier kodierte Proben von einer kommunalen und einer industriellen Kläranlage mit und ohne metabolische Aktivierung durch S9-Mix untersucht. Zwei der Proben waren im Vorfeld mit den Klastogenen Cyclophosphamid und Mitomycin C in definierten Konzentrationen aufdotiert worden.
Bewertungskriterium für Gentoxizität war die Verdünnungsstufe der Probe im Test bei der keine statistisch signifikante Erhöhung der Mikrokernrate mehr auftrat (LID; 'Lowest Ineffective Dilution'). Kriterium für Zytotoxizität war der Survival-Index, also die prozentuale Wachstumsrate der Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Als zusätzliche qualitative Merkmale wurden der Mitoseindex und der Proliferationsindex der Zellen bestimmt.
Results:
ERGEBNISSE. Obwohl mehrere der teilnehmenden Labore zuvor wenig bis keinerlei praktische Erfahrung mit dem in vitro- Mikrokerntest nach dem ISO-Entwurf hatten, können die Resultate als sehr gut bezeichnet werden. Es kam zu maximal 20% ungültigen Ergebnissen. Die beiden nicht-gentoxischen Proben wurden zu 100% bzw. zu 90% als negativ erkannt. Die mit Mitomycin C dotierte Probe (Soll: positiv ohne S9-Mix) wurde von allen Laboren richtig bewertet. Bei der Cyclophosphamid-Probe (Soll: positiv mit S9-Mix) erkannten 80% der Labore die Probe korrekt als positiv. In der Nachauswertung wurde festgestellt, dass die beiden falsch-negativen Ergebnisse auf technischen, nicht aber auf methodischen Mängeln beruhten. Die Resultate schwankten bei allen Proben maximal um eine Verdünnungsstufe bezogen auf den medianen LID-Wert. Der Survival-Index zeigte sich als robustes Maß für die Zytotoxizitätsabschätzung bei der Abwassertestung.
Discussion:
DISKUSSION. Die Detektion von Mikrokernen ist ein häufig verwendeter Parameter für das Erkennen zytogenetischer Schäden. Der Mikrokerntest ist anders als beispielsweise die Einzelzell-Gelelektrophorese (Comet-Assay) kein Indikatortestverfahren sondern zeigt bereits Mutagenität an, da irreparable DNA-Schäden analysiert werden. Treten Mikrokerne mit erhöhter Frequenz auf, ist in nachfolgenden Zellgenerationen mit schweren genetischen Schäden zu rechnen. Im Hinblick auf einen vorbeugenden Umwelt- und Gesundheitsschutz bedeutet dies, dass das Untersuchungsgut (Ab)Wasserprobe keine signifikante Erhöhung der Mikrokernrate hervorrufen sollte.
Conclusions:
SCHLUSSFOLGERUNGEN. Beim vorliegenden Ringversuch handelt es sich um den ersten Interlaboratoriums-Vergleich des Mikrokerntests mit Abwasserproben. Das Verfahren soll als eukaryontisches Pendant die bereits nach DIN und ISO standardisierten bakteriellen Verfahren umu-Test und Ames-Test komplementieren.
Recommendations and
Perspectives:
AUSBLICK. Die erfolgreiche Durchführung dieses Ringversuchs rechtfertigt die Überführung des ISO-Entwurf ('Draft International Standard') in den 'Final Draft International Standard' (FDIS), die letzte Vorstufe zur internationalen Norm. Es steht damit ein valides eukaryontisches Testsystem für die Wassertestung zur Verfügung

 

Measurement of Genotoxicity in Waste Water Samples - Results of a Collaborative Study on the In Vitro Micronucleus Test in the Context of Standardisation According to ISO Goal, Scope, and Background. In the context of the ISO-standardisation of the in vitro micronucleus test for (waste) water testing (ISO/DIS 21427-2), a national collaborative study was organized by the German Federal Institute of Hydrology (BfG) involving ten laboratories of private companies, universities and public authorities. The formation of micronuclei (MN) is a special kind of chromosomal aberration. To meet the standardisation requirements for this method, encoded waste water samples, some of them spiked with known genotoxins, had to be tested in a collaborative study. The study should demonstrate practicability of the in vitro micronucleus test for waste water testing and should provide validity data. Material and Methods. The micronucleus assay was performed with the permanently growing Chinese hamster lung fibroblast cell line V79. Four encoded samples from one municipal and one industrial wastewater treatment plant were tested with and without metabolic activation by S9-mix. Two of these samples were spiked in advance with defined concentrations of the clastogenic substances cyclophosphamide and mytomycin C. The defined assessment criterion for genotoxicity was the lowest dilution of a sample that does not show any significant induction of micronuclei (LID; lowest ineffective dilution). Cytotoxicity was judged by determining the survival-index, i.e. the percentage growth rate of the cells compared with the respective negative controls. As supplementary qualitative criteria, the mitotic index and the proliferation index were assessed.
Results. Although some of the laboratories had little or even no experience with the protocol of the in vitro micronucleus test described in the ISO-draft, all participants succeeded in establishing the assay within few weeks and in generating viable test results. The two nongenotoxic samples were detected as negative by 90% or 100% of the participants. The mitomycin C-spiked sample (expected to be positive without S9 supplementation) was correctly evaluated as positive by all laboratories. The cyclophosphamide-spiked sample (expected to be positive with S9 supplementation) was evaluated correctly as genotoxic by 80% of the laboratories. A post-test analysis found evidence that the false-negative results were due to technical failure, but not of a methodological nature. The sample LID values varied by no more than one dilution step around the median LIDvalue for all samples investigated. The survival index was proven to be a robust measure for estimation of cytotoxicity.
Discussion. The measurement of micronuclei is an important parameter for the detection of cytogenetic damage. In contrast to the singlecell gel electrophoresis assay (Comet assay), which is used as an indicator test, the in vitro micronucleus test detects non-repairable and thus manifested genetic damage. Consequently, the in vitro micronucleus test can be regarded as the more significant test system. A more frequent occurrence of micronuclei in treated cells suggests a risk of severe genetic damage for subsequent cell generations. In the interest of a precautionary environmental protection and health protection no municipal or industrial waste-water samples should show any significant induction of micronuclei in the treated cell populations.
Perspectives. The presented collaborative study was the first interlaboratory comparison of the in vitro micronucleus test using wastewater samples. The test system is intended to complement the already DIN- and ISO-standardised bacterial tests, i.e. the umu-test and the Ames plate incorporation assay. The data generated in the course of this project justify the transformation of the draft standard into the final draft international standard (FDIS), the preliminary stage of an international norm, so that a valid, standardised test system for the detection of eukaryotic genotoxicity in water samples might become available.

: http://publica.fraunhofer.de/documents/N-52053.html