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Zielgerichtete Eliminierung autoreaktiver B-Lymphozyten mithilfe Antigen-basierter Fusionsproteine

 
: Klose, D.

:
Fulltext ()

Aachen, 2017, IX, 121 pp.
Aachen, TH, Diss., 2017
German
Dissertation, Electronic Publication
Fraunhofer IME ()

Abstract
Autoantikörper spielen nicht nur für die Diagnostik zahlreicher Autoimmunerkrankungen eine entscheidende Rolle, sondern haben häufig auch eine pathogenetische Bedeutung. Im Laufe der letzten Jahre sind B-Zell-depletierende Therapien mittels monoklonaler Antikörper in klinischen Studien bei Patienten mit unterschiedlichen Autoimmunerkrankungen eingesetzt worden. Allerdings wurden die hohen Erwartungen in Placebo-kontrollierten, randomisierten Studien, z.B. beim Systemischen Lupus Erythematodes (SLE), nicht erfüllt. Dennoch bildet die Antigen-spezifische Beeinflussung autoreaktiver B-Lymphozyten über ihren B-Zellrezeptor (BZR) die Basis für ein neuartiges Behandlungskonzept, welches die chronisch-entzündlichen Vorgänge bei Autoimmunerkrankungen deutlich reduzieren könnte. Hierfür werden zytotoxisch wirksame Fusionsproteine eingesetzt, die aus einer zellspezifischen Zellbindedomäne (Autoantigenfragment) und einer Effektordomäne (bakterielle Toxine oder humane Enzyme mit pro-apoptotischem Potential) bestehen. Die vorliegende Doktorarbeit wurde innerhalb des von der Deutschen Forschungsgemeinschaft geförderten Projekts „B-Target“ in enger Zusammenarbeit mit dem Universitätsklinikum Münster (Abteilung Rheumatologie und medizinische Immunologie) durchgeführt. Ziel dieser Arbeit war es, ein Antigen-spezifisches Targeting von B-Lymphozyten unter Verwendung eines entsprechenden Modellantigens zu charakterisieren und die Technologie nachfolgend auf ein krankheitsrelevantes Autoantigen zu übertragen. Da entsprechend immunisierte Spender eine 0,1-0,2%ige Frequenz Tetanus-reaktiver Gedächtnis-B-Zellen im Blut aufweisen, wurde für die Machbarkeitsstudie als Modellantigen das bereits etablierte Tetanustoxin Fragment C (TTC) ausgewählt. Im ersten Teil der Arbeit wurden verschiedene TTC-basierte Fusionsproteine mittels prokaryotischer und eukaryotischer Expression hergestellt, gereinigt und abschließend in vitro charakterisiert. Eine spezifische Zellbindung der TTC-basierten Fusionsprotein und eine konzentrationsabhängige Toxizität des Fusionsproteins TTC-ETA' bestehend aus der gekürzten Version des bakteriellen Toxins Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A (ETA') konnte auf der TTC-reaktiver muriner Hybridomzelllinie 5E4 nachgewiesen werden. Weiterhin konnte eine zellspezifische Depletion ex vivo an frisch isolierten Antigen-reaktiven CD27+ Gedächtnis-B-Zellen dokumentiert werden. Für die in vitro-Charakterisierung TTC-basierter Fusionsproteine mit der Serpin B9 resistenten humanen Effektordomäne Granzym B (GrB R201K) und dem Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau (MAPTau) wurde eine humane lymphozytische TTC-reaktive REH-Zelllinie mithilfe der Transpo-mAb® Technologie (NBE Therapeutics, Basel, CH) generiert und eingesetzt. Hierfür wurden die variablen Antikörperfragmente der schweren und leichten Kette des anti (α)-TTC Antikörpers aus der murinen Hybridomzelllinie 5E4 identifiziert und in Transposon-basierte Expressionsvektoren kloniert. Nach erfolgreicher Generierung und Anreicherung von TTC-reaktiven lymphozytischen REH-Zellen, wurden die humanen TTC-Fusionsproteine in vitro charakterisiert. Dabei konnte eine Antigen-spezifische Zellbindung und Internalisierung der TTC-Fusionsproteine an TTC-reaktiven REH-Zellen dokumentiert werden. Im Vergleich zum TTC-MAPTau Protein wies das GrB(R201K)-TTC Protein eine spezifische konzentrationsabhängige Toxizität mit einer halbmaximalen effektiven Proteinkonzentration (EC50) von 0,77 ± 0,25 nM auf und induzierte Apoptose in TTC-reaktiven REH-Zellen. Diese neuen Erkenntnisse zeigen die Verwendung des GrBs als Effektordomäne innerhalb Antigen-basierter Fusionsproteine für einen therapeutischen Ansatz bei Autoimmunerkrankungen auf. Die im ersten Teil dieser Arbeit etablierten Methoden wurde anschließend auf die Verwendung eines pathorelevanten Autoantigens und die Entwicklung entsprechender Fusionsproteine translatiert. Dazu wurde die α1-Kette des extrazellulären Matrixproteins Laminin als potentielle Zielstruktur verwendet. Die Laminin α1-Kette enthält verschiedene Epitope, die von pathogenen autoreaktiven Antikörpern von SLE-Patienten erkannt werden. Es wurden Fusionsproteine mit verschiedenen Varianten des C-terminalen Bereiches der Laminin-α1-Kette mit den Domänen LG 3-5 kloniert, mittels prokaryotischer bzw. eukaryotischer Expression produziert und gereinigt. Sowohl im Serum als auch im Urin von SLE-Patienten konnten erste Nachweise von anti-Laminin-Autoantikörper mittels ELISA Untersuchungen dokumentiert werden. Weiterhin konnten in Seren und Urinproben von K14-CD40 Ligand transgener Mäuse, welche spontan SLE-ähnliche Symptome entwickeln, Laminin-reaktive Autoantikörper detektiert werden. Diese ersten positiven Ergebnisse wiesen auf einen bestimmten Abschnitt der Laminin α1-Kette als mögliches Zielepitop der Autoantikörper hin, sodass entsprechende Autoantigen-basierte zytotoxische Fusionsproteine generiert werden konnten. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierten Daten liefern wichtige Erkenntnisse für die zukünftige Weiterentwicklung Antigen-basierter Fusionsproteine mit zielzellspezifischer Zytotoxizität, die zur Eliminierung autoreaktiver B-Zell-Populationen und somit zur Reduktion chronischer Entzündungsprozesse beitragen können.

 

Autoantibodies play an import role in diagnostic of autoimmune diseases and significantly contribute to diseases pathogenesis. In the last years, several B-cell depletion strategies including monoclonal antibodies were used in clinical trials with patients of different autoimmune disorders. In case of systemic lupus erythematosus (SLE), the placebo-controlled randomized trials did not achieve the endpoints. Nevertheless, the antigen-specific modification of autoreactive B-lymphocytes via their specific B cell receptor (BCR) is the basis for a novel treatment approach of autoimmune diseases. Therefore, fusion proteins build of a target-cell specific binding domain (autoantigen) recombinant fused to an effector domain, a bacterial toxin or a human pro-apoptotic enzyme, were used to eliminate the target cell population. The project was initially funded by the DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) and carried out in close cooperation with the Münster University Hospital (Department of Rheumatology and Medical Immunology). The major goal of the thesis was the targeting of antigen-specific B cells via their unique BCR by either using first a model antigen and second a disease-relevant autoantigen. To successfully develop an active fusion protein, an appropriate cell targeting domain had to be identified. For the proof-of-concept we chose the well-established model-antigen tetanus toxoid fragment C (TTC). Vaccinated individuals have a frequency of 0.1-0.2% TTC reactive memory B cells in the periphery. Different TTC-based fusion proteins were cloned and subsequently produced using prokaryotic or eukaryotic expression systems followed by in vitro characterization. The specific targeting, binding and dose-dependent elimination of the recombinant fusion protein of TTC-ETA' was confirmed on the murine TTC-reactive hybridoma cell line 5E4 and on freshly isolated human antigen-specific CD27+ memory B cells. Subsequently, TTC-based human cytolytic fusion proteins consisting of a human effector domain, the microtubule-associated protein Tau (MAPTau) or granzyme B (GrB) mutant (R201K) were generated. For the in vitro characterization of these TTC-based fusion proteins, a human lymphocytic cell line was necessary. Here, the Transpo-mAb technology (NBE Therapeutics, Basel, CH), depending on transposon-based gene transfer, was used for the generation of a novel TTC-reactive REH cell line. Therefore, the variable fragments of the α-TTC antibody from the mouse hybridoma cell line 5E4 was rescued and cloned into the transposon-based expression vectors. After successful generation and enrichment of the TTC-reactive REH cell population the characterization of the TTC-based human cytolytic fusion proteins was performed. GrB(R201K) based human cytolytic fusion protein induced apoptosis in a dose-dependent manner with a half maximal effective concentration (EC50) of 0,77 ± 0,25 nM in contrast to the MAPTau based fusion proteins. According to these results, the GrB(R201K) effector domain could be a promising candidate for the generation of human cytolytic fusion proteins for autoimmune diseases treatment. In the next step, the established methods to generate cytotoxic fusion proteins were transferred on a SLE -relevant autoantigen using the laminin α1-chain. Different protein variants of the C-terminal laminin globular domains (LG3-5) of the laminin α1-chain were produced using prokaryotic or eukaryotic expression systems, respectively. By in vitro analysis of the novel human laminin-fusion proteins autoantibodies against the laminin α1-chain fragments could be detected in serum and urine samples of patients with SLE. Using the murine derived laminin-based fusion proteins anti-laminin autoantibodies could be detected in serum and urine samples of K14-CD40ligand (L) transgenic (tg) mice, which develop SLE-like symptoms. These results indicates that the laminin α1-chain could be used for further in vivo studies or generation of cytotoxic fusion proteins. In summary a new approach of the direct elimination of autoreactive B-lymphocytes using antigen-based fusion proteins was developed. Such novel antigen-based fusion proteins could be used for future development of tailor-made therapeutics in autoimmune diseases.

: http://publica.fraunhofer.de/documents/N-515418.html