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Expression und Charakterisierung von Sojaallergen-Varianten für Lebensmittelanalytik, Allergiediagnostik und Therapeutik

 
: Havenith, H.

:
Fulltext ()

Aachen, 2017, 108 pp.
Aachen, TH, Diss., 2017
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2017-013862
German
Dissertation, Electronic Publication
Fraunhofer IME ()

Abstract
Die sozioökonomische Bedeutung von Nahrungsmittelallergien hat in den vergangen Jahrzehnten stark zugenommen, was unter anderem an steigenden Kosten für die Behandlung allergieassoziierter Krankheiten und der steigenden Zahl an deklarierungspflichtigen Nahrungsmittelallergenen festgemacht werden kann. Dabei entwickelt sich durch die gesteigerte Relevanz von Nahrungsmittelallergien sowohl für die Lebensmittelindustrie als auch für das Gesundheitswesen ein Bedarf an standardisierten Messmethoden für die Analytik und Diagnostik von Allergenen. Allergene fungieren dabei zum einen als definierte Standards für eine verbesserte Lebensmittelkontrolle und eine in Einzelkomponenten aufgelöste Diagnostik und sind zum anderen die Basis für die Entwicklung von veränderten Allergen-Varianten für die Therapie von Allergien. Der Einsatz von rekombinanten Allergenen bietet dabei gegenüber nativ gereinigten Allergenen den Vorteil einer hohen Reinheit und reproduzierbarer Qualität. Da die Struktur der Allergene, einschließlich der Faltung und posttranslationaler Modifikationen, einen Einfluss auf die Erkennung der Allergene durch allergierelevante Antikörper nimmt, kann es für Nahrungsmittelallergene pflanzlichen Ursprungs von Vorteil sein, diese in einem auf Pflanzen basierten Expressionssystem herzustellen, um eine authentische Darstellung zu gewährleisten. In dieser Arbeit wurden am Beispiel von Soja, das zu den deklarierungspflichtigen allergieauslösenden Nahrungsmitteln zählt und dessen Verbreitung als Nahrungs¬mittel-bestandteil stetig zunimmt, sieben relevante Allergene hinsichtlich ihrer allergierelevanten IgE Epitope mittels Peptid-Mikro-Array Analyse charakterisiert. Die Evaluierung der Daten ermöglichte die Identifizierung von 68 Sequenzregionen, die sowohl bereits beschriebene IgE-Epitope bestätigen als auch neue Epitope bzw. aus einzelnen Sequenzabschnitten gebildete Epitopcluster beschreiben. Des Weiteren wurden bereits bekannte Sojaallergene im Bezug auf ihre Eignung für die Herstellung als rekombinante Proteine im pflanzlichen Expressionssystem bewertet. Dabei wurden insgesamt neun Allergene erfolgreich in den Expressionssystemen N. benthamiana oder über in vitro Transkription und Translation in einem auf Tabakzelllysat basierenden System produziert und Reinigungsprotokolle für die Allergene Gly m 3, Gly m 4 und Gly m TI etabliert, wodurch eine Proteinreinheit >95% erreicht wurde. Die durch die IgE-Epitop Analyse generierten Daten ermöglichten es in Kombination mit der erfolgreichen Expression und Reinigung des Gly m 4 Allergens Varianten mit verminderter Allergenität herzustellen, was zum einen die Validität der identifizierten IgE-Epitope bestätigte und zum anderen Perspektiven für den potenziellen Einsatz solcher Varianten als allergenspezifische Immuntherapeutika demonstrierte.

 

The socioeconomic impact of food allergy increased over the last decades, indicated by higher costs for allergy associated treatment and the increasing number of notifiable allergens. As a consequence, the demand for standardized detection and quantification methods required for analytical, diagnostic as well as therapeutic purposes has risen both in food industry and healthcare. On the one hand allergens serve as defined standard molecules improving analytical procedures in the quality control of food ingredients and enable better allergy diagnostics through single component resolution. On the other hand allergens constitute the basis for the development of tailor-made allergen variants for targeted allergen therapy. Recombinantly produced allergens provide the advantage of high purity combined with reproducible quality in contrast to allergen preparations isolated from native sources. The structure, determined by correct folding and appropriate posttranslational modifications, can influence the recognition of allergens by allergy-associated antibodies and is a critical point in recombinant allergen production. Therefore, the use of plant-based expression systems for the production of plant derived allergens is a promising strategy to ensure the authentic conformation of the allergen.As it is one of the major food allergens that has to be declared on food packaging and because of its high abundance as food ingredient, in this work soybean was used as a model case. Seven soybean allergens were analyzed in a peptide-micro-array to identify allergy related IgE epitopes. The data evaluation resulted in 68 sequence regions which confirmed epitopes for soybean allergens already described in literature and further more revealed new, previously unknown linear epitopes as well as presumably discontinuous epitope clusters formed by different sequence areas on the surface of the allergen structure. In addition, several known soybean allergens were evaluated regarding their suitability to be recombinantly produced in plant-based systems. A successful production either in N. benthamiana or in an in vitro translation system based on tobacco cell lysate could be shown for nine soybean allergens and for three of the allergens, Gly m 3, Gly m 4 and Gly m TI, an optimized purification protocol was established resulting in allergen purities >95%. Based on the results obtained through IgE epitope analysis it was possible to design and produce recombinant Gly m 4 variants. Featuring single amino acid substitutions in the dominant IgE epitopes these variants showed reduced cross-reactivity with soy specific Ig preparations (from patients and animals) indicating reduced immunogenicity. These results confirmed the validity of the generated epitope data and furthermore opens perspectives to use these kind of proteins as potential allergen specific immunotherapeutic agents.

: http://publica.fraunhofer.de/documents/N-515415.html