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Fluorescent toxicity endpoints as promising tools to progress the fish embryo test towards practical screening applications

 
: Delov, V.

:
Fulltext (PDF; )

Aachen, 2015, 102 pp.
Aachen, TH, Diss., 2015
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-040234
English
Dissertation, Electronic Publication
Fraunhofer IME ()

Abstract
Der Fischembryotoxizitätstest (FET) wird in der Ökotoxikologie seit Jahren als vielversprechende Alternativmethode zum Tierversuch diskutiert. Bislang wurde der Einsatzschwerpunkt des FETs mit dem Zebrafisch (zFET) ausschließlich bei der Ermittlung akuter Toxizitätsdaten von Chemikalien angesehen, bei der nur letale morphologische Effekte zum Tragen kommen. Für die Anwendung des FETs bei der Bewertung toxikologischer Wirkungen von Chemikalien, die weit über die akute Toxizität hinausgeht, werden weiterreichende, spezifische und vor allem quantifizierbare toxikologische Testendpunkte benötigt. Genexpressionsabhängige Fluoreszenzmarker und Färbemethoden die u.a. eine in vivo Detektion ermöglichen, bieten solch eine Möglichkeit. Innerhalb dieser Arbeit wurden alle in den Embryos auftretenden morphologischen Effekte mittels Hellfeld-Mikroskopie bestimmt. Gleichzeitig wurden anhand von fluoreszierenden, transgenen Zebrafischembryos der Linie Tg(fli1:EGFP)y1 zusätzliche Informationen zu i) Defekten auf die Blutgefäßentwicklung, ii) Tg(gfap:GFP) Embryos für die Detektion von Effekten auf die Radialglialzellen-Entwicklung, iii) Fluoreszenzfärbungen mittels spezifischer Antikörper gegen Myosin um Rückschlüsse auf das myotoxische Potential von Substanzen zu ermöglichen und zu letzt, iv) eine in vivo Färbemethode um Substanzinduzierte Veränderungen innerhalb der Apoptoserate der Embryos festzustellen, eingesetzt. Für eine Proof-of-concept-Analyse wurden anschließend Triclosan, Genistein und Cartap als Modellsubstanzen gewählt. Anhand der Fluoreszenzendpunkte konnten zugrundeliegende toxikologische Wirkmechanismen aufgezeigt werden, was zu einer Steigerung der Sensitivität und Spezifität des konventionellen zFETs führte. Es konnten Effekte bereits in geringeren Konzentrationen festgestellt werden, was eine erhöhte Sensitivität gegenüber den getesteten Substanzen in Anbetracht ihres primär toxischen Potentials (vaso-, neuro-, myotoxisch oder apoptotisch) unter Beweis stellte. Anhand der ISV-Längenmessung der Tg(fli1:EGFP)y1 Linie konnte sogar eine in vivo Identifizierung von (Vaso-) Toxizität bereits in 24 hpf Embryos erfolgen. Ferner konnte mittels zweier Fluoreszenzendpunkt-Methoden (ii und iv) eine Verknüpfung von Effekten auf der zellulärer Ebene, wie die gestörte Neuronalentwicklung und der gesteigerte Zelltod, mit den dazugehörigen, sogenannten initiierenden Ereignissen auf der molekularen Ebene, aufgezeigt werden. Dies untermauert die Anwendbarkeit von Genexpressionsprofilen in der Umweltrisikoanalyse. Zudem zeigen die Ergebnisse, dass die Defizite des klassischen zFETs, wie die geringe Objektivität, die hohe Fehlerrate sowie die aufwändige Auswertung, durch die Quantifizierung der Fluoreszenzendpunkte vermindert werden können. Auch wird die Möglichkeit für eine Computergestützte, automatisierte Bildanalyse aufgezeigt, was die Anwendbarkeit des zFET für industriell einsetzbare Hochdurchsatz-Screenings signifikant steigern würde.

The fish embryo toxicity test (FET) is currently one of the most advocated animal alternative tests in ecotoxicology. To date, the application of the FET with zebrafish (zFET) has focused on acute toxicity assessment, where only lethal morphological effects are accounted for. An application of the zFET beyond acute toxicity, however, necessitates the establishment of more refined and quantifiable toxicological endpoints. A valuable tool in this context is the use of gene expression-dependent fluorescent markers and staining methods that can even be measured in vivo. In this thesis all sublethal morphological effects occurring in the embryos were determined by bright field microscopy, and, in parallel, fluorescent transgenic zebrafish embryos of Tg(fli1:EGFP)y1 were used to gain supplementary information on i) defects of blood vessel development, ii) Tg(gfap:GFP) embryos for detecting effects on radial glial cell development, iii) fluorescent staining with antibody against myosin to allow for conclusions on the myotoxic potential of substances and lastly, iv) an in vivo staining method in order to notice substance-induced changes in the apoptosis rate of the embryo. For a proof-of-concept study, the chemicals triclosan, genistein and cartap were selected as test compounds. On the basis of these quantifiable fluorescence endpoints, underlying toxicological mechanisms were elucidated what, in turn, proved to increase the sensitivity and specificity of the conventional zFET. In this study, the newly invented fluorescence endpoints showed a higher sensitivity of tested chemicals in accordance to their toxic potential (vaso-, neuro-, myotoxic or apoptotic potential), since effects were determined at lower concentrations in the test approach. The analysis of the ISV (intersegmental vessel)-length in Tg(fli1:EGFP)y1 enabled an in vivo detection of (vaso-) toxicity already in 24 hpf embryos. Moreover, two of the fluorescence endpoints methods (ii and iv) were able to link cellular effects of disturbed neural development and increased cell death to the molecular initiating events, what could contribute to the acceptance and application of gene expression profile data in risk assessment. Furthermore, the results demonstrate that quantifying fluorescence endpoints prevents deficiencies of the traditional zFET, which are low objectivity, high error rate and sophisticated assessment. Additionally, the fluorescence analysis depicted the potential for computer-based automated image analysis, what would significantly improve the applicability of the zFET in industrial used high-throughput screenings.

: http://publica.fraunhofer.de/documents/N-439255.html