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2013
Doctoral Thesis
Titel
Expression and characterization of infectious bursal disease virus protein for poultry vaccine development and application in nanotechnology
Titel Supplements
Expression und Charakterisierung des infektiösen Bursitis-Virus-Proteins für die Geflügel-Impfstoffentwicklung und Anwendung in der Nanotechnologie
Abstract
Das Infectious bursal disease virus (IBDV) ist der Auslöser der infektiösen Bursitis bei jungen Hühnern. IBDV führt weltweit zu beträchtlichen ökonomischen Schäden in der Geflügelindustrie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die cDNA für das selbst-assemblierende Capsid-Protein (VP2, IBDV Stamm IR01) in den Pflanzenexpressionsvektor pTRAkc kloniert und in Tabak exprimiert. Bei transienter Expression wurden für das rekombinante Protein eine Akkumulation von 260 µg/g Frischgewicht im Apoplasten und 160 µg/g Frischgewicht im Cytosol von Tabakblattgewebezellen beobachtet. Analog wurden in stabil transformierten Pflanzenlinien 20-30 µg/g bzw. 10-20 µg/g festgestellt. Das VP2 lag dabei in trimerisierter und nicht wie erhofft in größeren Aggregationsformen vor. Trotzdem war das rekombinante VP2 Protein hoch-immunogen in Mäusen. Alternativ wurde VP2 in den Hefeexpressionvektor pPICZ_B kloniert und in Pichia pastoris produziert. Bei Expression in Hefezellen konnte die Assemblierung von VP2 Monomeren in ~23 nm subvirale Partikel (SVPs) beobachtet werden. Dabei wurden für das rekombinante Protein eine Produktivität von 76 mg pro Liter Kultuvolumen erreicht und die finale Ausbeute nach Reinigung lag bei 38 mg/l. Nach parenteraler und oraler Vakzinierung von Hühnern mit gereinigtem oder Pichia-verkapseltem IBD-SVPcyto konnten IBDV-spezifische Antikörperantworten nachgewiesen werden. Die vakzinierten Tiere wurden mit dem heterologen IBDV-Stamm MB3 infiziert und beobachtet. Anschließend wurden Antikörperantworten, Mortalität, Virus Clearance, Bursale Läsionen und Atrophien sowie das Verhältniss Bursagewicht zu Körpergewicht gemessen und analysiert. Während für intramuskulär verabreichtes, gereinigtes IBD-SVPcyto (20 µg) vollständige Protektion und Virus Clearance sowie die komplette Abwesenheit von Bursaschäden beobachtet wurde, waren bei nicht- oder Mock-immunisierten Tieren eine hohe Mortalitäts-Rate von 60% sowie starke bursale Läsionen und Atrophien zu verzeichnen. Ein als Kontrolle verwendetes kommerzielles Vakzin erreichte ebenfalls vollständige Protektion und Virus Clearance. Auch hier wurden bursale Atrophien beobachtet. Orale Administration von gereinigtem IBD-SVPcyto (500 µg) mit und ohne Adjuvant induzierte eine 100%ige Protektion, wobei nur in Kombination mit dem Adjuvant eine Virus Clearance von 60% beobachtet werden konnte. Bursale Läsionen konnten in beiden Fällen beobachtet werden. Die Administration von 250 mg Pichia-verkapseltem IBD-SVPcyto mit und ohne Adjuvant resultierte in 100%- bzw. 60%iger Protektion, wobei in beiden Gruppen nur moderate bursale Läsionen oder Atrophien festgestellt wurden. In den Gruppen, denen entweder 25 mg Pichia-verkapseltes IBD-SVPcyto oder 50 µg gereinigtes IBD-SVPcyto verabreicht wurde, konnte ein Schutz von 90-100% sowie 40-60% beobachtet werden. Dabei waren in der ersten Gruppe moderate bursale Läsionen und starke Atrophie und in der zweiten Gruppe starke bursale Läsionen und Atrophien zu verzeichen. Über Monitoring und Vergleich der Versuchstier-Lebendgewichte über den Verlauf der Studie wurde außerdem demonstriert, dass es keinen Einfluss der Immunisierungen auf das Wachstum der Tiere gab. In dieser Arbeit konnte erfolgreich gezeigt werden, dass in Pichia produzierte subvirale IBDV Partikel sowohl bei parenteraler als auch bei oraler Verabreichung protektive, lokale und systemische Immunantworten gegen IBDV auslösen können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Eignung von Pichia-produzierten subviralen IBDV Partikeln (IBDV-SVPs) als neuartige Nano-Platform untersucht. Gereinigte IBDV-SVPs waren in bis zu 20%tigen Lösungen der organischen Lösungsmittel Ethanol und Dimethylsulfoxid stabil und wiesen eine hohen Temperatur- und pH-Stabilität (65@C, pH 2.5-9.0) auf. Eine Funktionalisierung konnte am Beispiel der Biokonjugation von Biotin an auf der Oberfläche der IBDV-SVPs liegende Aminogruppen (Lysin) oder Carboxylgruppen (Aspartat und Glutamat) demonstriert werden. Über die Kopplung von Alexa Fluor 488 N-hydroxysuccinimid (NHS) Ester konnte die hohe Zahl von adressierbaren Aminogruppen (>60) pro IBDV-SVPs quantitativ bestätigt werden. Mit diesen Studien konnte gezeigt werden, dass IBDV-SVPs robuste und vielseitig funktionalisierbare Nanopartikel mit großem Entwicklungspotenzial darstellen.
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Infectious bursal disease virus is a causative agent of infectious bursal disease in young chickens causing significant losses to the poultry industry worldwide. In this study the gene encoding the viral capsid protein (VP2, IR01 strain) with self-assembly capability was cloned into a plant expression pTRAkc vector and expressed in tobacco. Recombinant protein levels in tobacco leaves reached to 260 µg/g and 160 µg/g fresh leaf weights (FLW) in apoplastic and cytosolic protein accumulation, respectively. These numbers were 20-30 µg/g and 10-20 µg/g FLW in stable transformation while the assembly level did not reach higher than trimers. Nonetheless the recombinant VP2 protein was highly immunogenic in mice. Alternatively, VP2 was cloned into the yeast expression vector, pPICZ_B, and produced in Pichia pastoris resulting in the formation of ~23 nm homomeric subviral particles (SVPs) composed of the VP2 protein. The recombinant protein levels reached 76 mg/l culture and the final yield after purification was 38 mg/l. Anti-IBDV antibodies were detected in chickens vaccinated by injection of purified IBD-SVPcyto or by feeding either purified IBD-SVPcyto or recombinant Pichia expressing IBD-VP2cyto. Challenge of vaccinated chickens with the heterologous IBDV strain (MB3) and subsequent analysis of antibody response, mortality, virus clearance, bursal damage score and bursa weight to body weight (BF/BW) ratio demonstrated that 20 µg of purified IBD-SVPcyto intramuscularly administered confers full protection, complete viral clearance and thoroughly prevents bursal damage and atrophy whereas the mortality rate in non-vaccinated and mock-immunized groups was 60% with a high bursal damage score and atrophy. Commercial vaccine also conferred full protection and viral clearance while partial bursal atrophy was inevitable. Orally administered purified 500 µg IBD-SVPcyto with and without adjuvant conferred 100% protection, however, only in companion with adjuvant showed 60% viral clearance and in the absence of the adjuvant showed no viral clearance. In both cases, moderate bursal damage was observed whereas in combination with adjuvant provided BF/BW ratio similar to live-attenuated vaccine and intramuscularly administered 20 µg of purified IBD-SVPcyto. Administration of 250 mg of Pichia-capsulated IBD-SVPcyto with and without adjuvant resulted in 100% and 60% protection, respectively. Moderate bursal damage and moderate atrophy was present in both groups. In the groups that received 25 mg of Pichia-capsulated IBD-SVPcyto and purified 50 µg IBD-SVPcyto, the protection rate was 90-100% and 40-60%, respectively. In the first group moderate bursal lesions and severe atrophy and in the latter groups severe bursal lesions and severe atrophy was observed. Monitoring the weight of chickens as a health index showed no interruption of vaccination in growth rate. This study demonstrates the ability of Pichia-produced IBD-SVPcyto to induce specific immune response against IBDV either in oral or parenteral administration. The ability of orally administered vaccine in induction of protective local as well as systemic immune response is demonstrated. In the second part of this study, the potential application of Pichia-produced IBD-SVPcyto as a novel nano-platform was investigated. The purified particles were able to tolerate organic solvents up to 20% concentration (ethanol or dimethylsulfoxide); they resisted temperatures up to 65 C and remained stable over a wide pH range (2.5-9.0). Bioconjugation to the amine groups of lysine residues and to the carboxyl groups of aspartic and glutamic acid residues were achieved, allowing the functionalization of IBD-SVPcyto with biotin. The accessibility of surface amine groups was measured using Alexa Fluor 488 N-hydroxysuccinimide (NHS) ester, an amine-selective fluorescent dye, revealing that approximately 60 dye molecules were attached to the surface of each particle. IBD-SVPcyto can therefore be exploited as a robust and versatile nanoscaffold to display diverse functional ligands.
ThesisNote
Aachen, TH, Diss., 2013
Verlagsort
Aachen