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2013
Doctoral Thesis
Titel
CD64-mediated specific elimination of M1-polarized macrophages : implications for therapeutic intervention in chronic inflammatory disease
Titel Supplements
CD64-vermittelte spezifische Elimination von M1-polarisierten Makrophagen : Möglichkeiten für eine therapeutische Intervention bei chronischen Entzündungskrankheiten
Abstract
Macrophages are key players of the innate immunity and versatile cells that can adapt to microenvironmental signals resulting in distinct polarization states with altered phenotype and function. The dynamic ratio of M1 and M2 polarized macrophages is critical for the appropriate development and resolution of inflammation. In chronic diseases, this normal progression is arrested in the M1 dominant phase. In this thesis, the lack of available therapy strategies for treatment of chronic inflammatory diseases was addressed using CD64-targeted immunotoxins. Murine and human macrophages were polarized and characterized using a set of membrane and soluble markers. Among several other surface receptors including CD14, CD16 and MHCI/II, CD64 was unique due its increased expression in both murine and human M1 cells. M1 macrophages were also characterized by the increased production of pro-inflammatory cytokines such as IL-12, IL-6 and TNF-a. In contrast, CD206 and CD301 were more abundant on the surface of M2 macrophages and the pro-inflammatory cytokines listed above were suppressed. In vitro targeting experiments revealed the exclusive elimination of M1 type macrophages by three different hCD64-targeted proteins: the chimeric IT H22(sFv)-ETA' and the two fully human fusion proteins H22(scFv)-Angiogenin and Granzyme B-H22(scFv). Staining with AnnexinV-FITC confirmed that H22(scFv)-ETA' selectively induced apoptosis in M1 macrophages. M1-specific susceptibility was shown to be due to a reduced endosomal protease activity. These results were confirmed in vivo in a SLS-induced cutaneous chronic inflammation model in transgenic mice and ex vivo in a skin biopsy from a patient with atopic dermatitis. In addition, both populations showed phenotypic plasticity and after conversion into either type, only M1 polarization resulted in sensitivity towards the CD64-directed immunotoxin. In an attempt to replace the immunogenic bacterial toxin ETA' with a fully human effector protein, the ability of the human microtubule-associated protein tau (MAP) to act as a pro-apoptotic protein was investigated. Therefore, MAP was cloned in frame with H22(scFv), expressed in E. coli, and purified by standard chromatographic methods. Successful binding of H22(scFv)-MAP to the promyelocytic leukemia cell lines HL-60 and U937, and to polarized macrophages, was confirmed by flow cytometry. In vitro cell viability assays revealed the proliferation-dependent cytotoxicity of H22(scFv)-MAP. The in vivo performance was tested in the transgenic mouse model described above, revealing that H22(scFv)-MAP also selectively eliminated M1 macrophages, while leaving M2 macrophages unaffected. The successful killing of M1 macrophages by H22(scFv)-MAP, which confers cytotoxicity to proliferating cells only, suggested that fully differentiated and polarized tissue macrophages proliferate in situ. The local proliferation of M1 macrophages was confirmed by immunohistochemical analysis. In summary, these results show that CD64 is an appropriate target for therapeutic approaches focusing on M1 macrophages and attempting to alter their function or role in chronic inflammation. Specific targeting of M1 macrophages provides a therapeutic strategy to intervene in most chronic inflammatory diseases, e.g. rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease and chronic wounds.
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Makrophagen spielen eine wichtige Rolle im angeborenen Immunsystem. Durch ihre Flexibilität können sie sich durch Signale aus der Mikroumgebung anpassen, indem sie ihren Polarisierungsstatus sowohl phänotypisch als auch funktional verändern. Das dynamische Verhältnis zwischen M1- und M2-polarisierten Makrophagen ist kritisch für eine kontrollierte Entstehung und Auflösung einer Entzündung. In chronischen Krankheiten ist dieses Verhältnis zu einer M1-Dominanz verschoben. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe von CD64-gerichteten Immuntoxinen der Mangel an verfügbaren Therapiestrategien für chronische Entzündungskrankheiten adressiert. Murine und humane Makrophagen wurden polarisiert und unter Verwendung einer Anzahl von membrangebundenen und löslichen Markern charakterisiert. Zusätzlich zu einigen anderen Oberflächenrezeptoren, wie CD14, CD16 und MHCI/II, war CD64 ein geeigneter Marker für murine und humane M1 Makrophagen. M1 Makrophagen wiesen außerdem eine erhöhte Produktion an pro-inflammatorischen Cytokinen wie IL-12, IL-6 und TNF-alpha auf. Im Gegensatz dazu waren eine erhöhte Oberflächenexpression von CD206 und CD301 und eine schwache Produktion von löslichen pro-inflammatorischen Mediatoren charakteristische Merkmale von M2 Makrophagen. In vitro Cytotoxizitätsexperimente resultierten in einer selektiven Elimination von M1 Makrophagen durch drei verschiedene Fusionsproteine: das chimäre immuntoxin H22(scFv)-ETA' und die beiden voll-humanen Fusionsproteine H22(scFv)-Angiogenin und Granzyme B-H22(scFv). Die Anfärbung mit AnnexinV-FITC bestätigte, dass H22(scFv)-ETA' selektiv in M1 Makrophagen Apoptose induziert. M1-spezifische Sensitivität basierte auf einer reduzierten endosomalen Proteaseaktivität. Diese Ergebnisse wurden in vivo in einem transgenen Maushautmodell für SLS-induzierte chronische Hautentzündung und ex vivo in einer Hautbiopsie eines Patienten mit atopischer Dermatitis bestätigt. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass beide Makrophagenpopulationen phänotypische und funktionale Plastizität aufwiesen und nach Umpolarisierung nur der M1 Phänotyp sensitiv für das CD64-gerichtete Immuntoxin war. Um das immunogene bakterielle Toxin ETA' mit einem voll-humanen Effektorprotein zu ersetzen, wurde das humane mikrotubuli-assoziierte Protein tau (MAP) auf seine pro-apoptotischen Eigenschaften untersucht. MAP wurde als Fusion mit H22(scFv) kloniert, in E. coli exprimiert und mittels standardmäßiger Chromatographien gereinigt. Die erfolgreiche Bindung von H22(scFv)-MAP an zwei pro-myelocytäre Leukemiezelllinien HL-60 und U937 und an polarisierte Makrophagen wurde mittels Durchflusscytometrie bestätigt. In vitro Cytotoxizitätsexperimente zeigten eine proliferationsabhängige Cytotoxizität von H22(scFv)-MAP. In Analogie zu H22(scFv)-ETA' wurde die in vivo Aktivität von H22(scFv)-MAP im transgenen Mausmodel getestet und resultierte ebenfalls in einer selektiven Elimination von M1 Makrophagen. Die erfolgreiche Elimination von M1 Makrophagen durch H22(scFv)-MAP, welches nur proliferierende Zellen tötet, deutete außerdem darauf hin, dass differenzierte und M1 polarisierte Makrophagen in situ proliferieren. Die lokale Proliferation von M1 Makrophagen wurde immunohistochemischen Analysen bestätigt. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass CD64 ein geeignetes Zielmolekül für M1-spezifische therapeutische Anwendungen darstellt. Ein spezifisches und selektives Ansteuern von M1 Makrophagen stellt daher eine neue therapeutische Interventionsstrategie für viele chronische Entzündungskrankheiten, wie z.B. rheumatoide Arthritis, chronisch-entzündliche Darmerkrankungen und chronische Wunden, dar.
ThesisNote
Aachen, TH, Diss., 2013
Verlagsort
Aachen