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Recombinant cellulase production in plants

Produktion rekombinanter Cellulasen in Pflanzen
 
: Klose, H.

:
Fulltext (PDF; )

Aachen, 2014, V, 88 pp.
Aachen, TH, Diss., 2014
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-50622
English
Dissertation, Electronic Publication
Fraunhofer IME ()

Abstract
Enzyme-catalyzed lignocellulose conversion is a promising pathway to increase the feasibility of second generation biofuel production. The development of viable processes for enzymatic lignocellulose utilization must address different issues to become economically feasible. One important issue is the production of appropriate and cost-effective enzymes to deconstruct the complex and heterogeneous structure of the lignocellulose. Plant based expression of cell wall degrading enzymes is a promising technique, but it currently faces a number of challenges, such as enzyme expression levels and auto-hydrolysis of the plant cell walls. This thesis deals with establishing and evaluating cellulase expression strategies in tobacco plants, including differential protein targeting, inducible protein expression and the implementation of enzymes with different biochemical properties, such as thermophile. Different approaches of in planta produced cellulases are evaluated by the analysis and their properties as well as by detailed phenotypical analyses, such as biochemical characterization of plant cell walls. Constitutive high level expression of a mesophilic cellulase led to detrimental changes in the plant phenotype, including growth and development. The retention of the enzyme inside the endoplasmic reticulum could not completely avoid this impact on the plant development. The application of an alcohol inducible promoter for cellulase production led to enzyme expression rate without any significant phenotypical effects on the plant. Hyperthermophilic cellulases are inactive under normal plant growth conditions, allowing their expression in plants without negative effects on growth and development. Subsequent heat-inducible activation enables lignocellulose degradation. The expression rate of these hyperthermophilic enzymes is at lower levels than that of mesophilic enzymes. However, this enzyme was shown to survive harsh pretreatment conditions. Therefore it is a promising candidate for an advanced enzymatic conversion of lignocellulosic biomass. This study established advanced basic knowledge for plant based production of cellulolytic enzymes and subsequently the developed and evaluated new production strategies for cellulases would provide an advanced enzymatic conversion processes of plant biomass.

 

Die Umwandlung von Lignocellulose zu fermentierbaren Zuckern durch Enzyme ist ein vielversprechender Ansatz zur nachhaltigen Herstellung von Biokraftstoffen. Die Entwicklung realisierbarer Prozesse für die Enzym-katalysierte Nutzung von Lignocellulose muss verschiedene Gesichtspunkte berücksichtigen, um ökonomisch rentable und nachhaltige Verfahren zu erstellen. Die kostengünstige Produktion geeigneter Enzyme zum Abbau der komplexen Struktur lignocellulosehaltiger Biomasse ist dabei ein wesentlicher Kernpunkt. Pflanzen bieten eine kostengünstige und vielversprechende Alternative zur Produktion solcher Enzyme. Zurzeit müssen solche pflanzlichen Systeme jedoch noch hinsichtlich der Enzym-Ausbeute und der potentiellen Schädigung der Pflanze durch das Enzym optimiert werden. Die vorliegende Studie diente der Entwicklung und Evaluation von Strategien zur Expression von Cellulasen in Tabakpflanzen. Hierbei wurden unterschiedliches Protein-Targeting, induzierbare Expression sowie die Expression Temperatur-aktivierbarer Enzyme untersucht. Die verschiedenen Ansätze wurden hinsichtlich der biochemischen Eigenschaften der produzierten Cellulasen analysiert. Zudem wurden die erstellten transgenen Tabakpflanzen auf Veränderungen des Phänotyps, insbesondere der biochemischen Zusammensetzung der pflanzlichen Zellwände hin untersucht. Die konstitutive Expression einer mesophilen Cellulase führte zwar zu hohen Expressionsraten, jedoch wurden auch signifikant Änderungen im Wachstum und der Entwicklung der transgenen Pflanzen festgestellt. Die Retention der Cellulase im Endoplasmatischen Reticulum konnte diesen Einfluss auf die Entwicklung der Pflanze nicht vollständig verhindern. Die Verwendung eines Alkohol-induzierbaren Promotorsystems zur Produktion der Cellulase führte hingegen nicht zu signifikanten Änderungen im Phänotyp der Pflanzen. Vergleichbare Ergebnisse wurden mit der Verwendung einer hyperthermophilen Cellulase erzielt, die unter den Wachstumsbedingungen der Pflanze inaktiv vorliegt und erst durch hohe Temperaturen aktiviert werden kann. Zwar wurde für dieses Enzym eine geringere Ausbeute erzielt als für das mesophile Enzym, jedoch zeigt es sehr hohe Toleranz gegenüber den harschen Bedingungen während bei konventioneller Vorbehandlungsmethoden zur Verzuckerung von Biomasse und ist ein vielversprechender Kandidat für neue verbesserte Prozesse zur enzymatischen Biomassekonversion. Die innerhalb dieser Arbeit erzielten Daten ermöglichen erweiterte Erkenntnisse zur Expression von Cellulasen in Pflanzen. Die daraus erfolgte Entwicklung und Evaluierung neuer Produktionsstrategien kann in Zukunft einen Beitrag zu einer verbesserten und nachhaltigen Nutzung pflanzlicher Biomasse liefern.

: http://publica.fraunhofer.de/documents/N-356449.html