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2012
Master Thesis
Titel
Versuche zur Identifizierung von Serummarkern in Allergiker-Seren mittels Peptid-Phagen-Display
Abstract
Die Zahl der allergischen Krankheiten, insbesondere Atopische Dermatitis, steigt in den westlichen Industrieländern. Neue Ansätze der Krankheitsprävention gehen von der Identifizierung von Personen mit hohem Krankheitsrisiko aus. Geeignete Sceening-Methoden fehlen bisher. Phagen-Display mit Peptiden ist eine Technologie mit der geeignete Allergie-Marker aus Blutseren identifiziert werden können. Ziel dieser Arbeit war deshalb die Identifikation von spezifischen IgG oder IgE-Bindern aus atopischen Seren. Um mit Hilfe des Phagen-Displays nicht nur Binder an der Hauptproteinfraktion, zum Beispiel Serumalbumin, zu selektieren, wurde eine Kompetition durchgeführt. Dazu wurde eine Mischung verschiedener nicht-atopischer Seren zusammen mit der Phagen-Peptid-Bibliothek inkubiert. Um Binder mit besseren Bindungseigenschaften zu erhalten, wurde die hypervariable Region der vorselektierten Liganden mittels cosmix-plexing rekombiniert. Die Phagen-Peptid-Bibliothek wurde zur Selektion auf zwei verschiedenen atopische Seren eingesetzt. Die so entstandenen Subbibliotheken wurden zur Selektion auf zwei weiteren Seren eingesetzt. Die selektierten Klone wurden sequenziert und im Dot-Blot und ELISA getestet. Nach drei Selektionsrunden konnten keine angereicherten Peptide an den Hauptbestandteilen des Serums identifiziert werden. Durch die Selektion der Subbibliotheken auf zwei weitere Seren konnten viele Binder identifiziert werden, die nicht nur an Immunglobuline aus einem Serum binden. Die meisten selektierten Peptide reagierten im ELISA mit mehreren Seren. Mit Hilfe des ELISAs konnten die analysierten Klone hauptsächlich als potentielle IgE-Binder identifiziert werden. Mit Hilfe der Sequenzanalyse konnten einige Mimotope identifiziert werden, die eventuell eine allergieauslösende Wirkung haben. So konnten bei viele Peptiden Ähnlichkeiten zu Proteinen aus Schimmelpilzen identifiziert werden. Die vorliegende Arbeit belegt, dass das Phagen-Display eine geeignete Methode ist, um patientenspezifische Markermoleküle zu identifizieren und das diese genutzt werden können, um Immunglobuline, IgE oder IgG aus anderen Patientenseren zu identifizieren.
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Numbers of atopic disease in the western industrialized countries are increasing. For a long time now its cause and new therapeutic approaches are under investigation. New approaches of disease prevention arise from the identification of high-risk individuals. Adequate screening methods are missing so far. With the peptide phage display technology allergy marker from blood serum can be identified. The aim of this work was therefore the identification of specific IgG or IgE-binders from atopic sera. To eliminate the binders to major serum protein fraction, a counter selection was performed. This was done by using a mix of non-atopic donor sera during the selection on atopic donor serum. To obtain binder with better binding properties, the hypervariable regions of preselected libraries were recombined by using the cosmix-plexing technology. The phage peptide library was used for selection on two different atopic sera. The preselected libraries were used for the selection on two further sera. The individual clones were sequenced and analysed in the phage dot blot assay and ELISA. After three selection rounds an enrichment of binders to major serum protein fraction could not be found. By the selection on two different sera of preselected libraries many binders could be identified. These peptides were able to bind to immunoglobulines from several sera. Most of these selected clones reacted with several different sera in ELISA assay. By ELISA assay most of the analyzed clones could be identified as potential IgE-binder. By sequence analysis some mimotope were observed which may have an allergy-causing effect. For example, some peptides are homolog to proteins from mold fungi. The present work demonstrates that the phage display method is a promising tool for the successful selection of patient-specific marker molecules. Some of these patient-specific marker molecules can be used to identify immunoglobulins from other patient sera.
ThesisNote
Potsdam, Univ., Master Thesis, 2012
Advisor
Verlagsort
Potsdam