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Entwicklung eines präzisen, schnellen und automatischen Biochip-Systems für patientennahe Sepsis-Diagnostik

Development of a precise, fast and automated biochip-system for sepsis diagnostics
 
: Kemmler, Manuel

:
Fulltext ()

Freiburg/Brsg., 2011, 155 pp.
Freiburg/Brsg., Univ., Diss., 2010
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-82016
German
Dissertation, Electronic Publication
Fraunhofer IPM ()
biochip; immunoassay; TIRF; sepsis; diagnostic; point-of-care-testing

Abstract
Sepsis ist ein Krankheitsbild, bei dem ein schnelles Diagnoseverfahren benötigt, damit die richtige Therapie vom Arzt für den Patienten schnell gewählt werden kann. Point-of-Care-Testing (POCT) bezeichnet solche patientennahe Tests. POCT kann die Zeit von der Probenentnahme bis zum Erhalt des Testresultats, die so genannte Therapeutic-Turn-Around-Time (TTAT), deutlich verkürzen. Zusätzlich bedeutet POCT eine Dezentralisierung der großen Zentrallabore. Denn das Analysegerät kommt zum Patienten und nicht der Patient bzw. die Patientenprobe zum Analysegerät. Dadurch können wichtige diagnostische Entscheidungen schneller getroffen und die Therapie folglich früher gestartet werden. Dies kann bei der Sepsis Leben retten, denn die Überlebenschance eines Patienten mit Sepsis nimmt stündlich um 6 % ab. Aktuelle Studien zur Sepsis zeigen hohe Sterberaten auf, allein in Deutschland sterben 60 000 Menschen pro Jahr an den Folgen der Sepsis. Diese hohe Sterblichkeit zu reduzieren, ist somit von großem gesellschaftlichem Interesse, was durch ein geeignetes POCT-System erreicht werden könnte. Einsatzgebiete eines solchen POCT-Systems können hierfür beim Notdienst, im Operationssaal, auf Intensivstationen, in ambulanten Bereichen oder direkt in den Arztpraxen sein.
Für die Diagnose von Sepsis können spezielle Immun-Tests verwendet werden. Diese sind so konzipiert, dass sie bestimmte Parameter in einer Blutprobe detektieren können, um eine konkrete Diagnose zu stellen. Für die Diagnose einer Sepsis werden sehr häufig die Parameter C-reaktives Protein, Interleukin-6, Procalcitonin und Neopterin eingesetzt. Auf Grund der schnellen Testzeit ist es deshalb von Vorteil die benötigten Parameter gleichzeitig zu erfassen. Daher sollte das Testformat in der Lage sein, diese Parameter parallel zu erfassen, also mit einem Multi-Parameter-Test. Ziel der Diagnose ist es, zwischen einem Systemic Inflammatory Response Syndrom (SIRS), Sepsis, schwerer Sepsis und septischem Schock unterscheiden zu können, da diese Differenzierung "essentiell für die spezifische Therapie" für den Patienten ist.
Ziel der Arbeit ist es, einen Multi-Parameter-Test für die Diagnose einer Sepsis mit den vier Analyten C-reaktives Protein (CRP), Interleukin-6 (IL-6), Procalcitonin (PCT) und Neopterin (NPT) zu etablieren. In diesem Zusammenhang wird ein Multi-Parameter-Test auf das Format eines neuen optischen Detektionssystems übertragen und für die Diagnose einer Sepsis optimiert. Das Detektionssystem ist ein Wellenleiterfluorometer (WLS) und stand zum Beginn der Arbeit zur Verfügung. Das WLS ist in der Lage, Signale eines fluoreszierenden Mikroarrays hoch-sensitiv zu erfassen. Der zu übertragende Test ist ein Fluoreszenz-Immun-Test auf Basis von Mikroarrays auf Objektträgern des Projektpartners Austrian Institute of Technology, der manuell prozessiert wird. Der lineare Messbereich der Parameter im System soll die physiologischen Werte bis hoch zu den pathogen erhöhten Werten abdecken. Da CRP mit 1-5 mg/l im Serum physiologisch einen hohen Wert aufweist und im Vergleich IL-6 dazu einen sehr niedrigen Wert von < 10 ng/l, kann der Test nicht einfach durch Verdünnen des Plasmas eingestellt werden. Dennoch wird verdünnt, um Matrix-Effekte zu minimieren. Als Matrix-Effekte werden in der Probe befindliche Stoffe genannt, die neben dem Analyten auftreten und das Test-Signal negativ beeinflussen. Der Test wird auf die zu entwickelnde Fluidik-Einheit übertragen. Die Durchführung des Tests soll vollautomatisiert ablaufen und innerhalb kürzester Zeit prozessiert werden. Die Testzeit soll unter 30 Minuten liegen, so dass das Gerät POCT-Kriterien erfüllt. Der Zeitaufwand für das Testformat, welches ohne Gerät prozessiert wird, beträgt ca. drei Stunden, d. h. die Testzeit muss drastisch reduziert werden. Zusätzlich soll die Fluidik-Einheit aus wenigen Komponenten aufgebaut sein, mit wenigen Mikrolitern Probenvolumen auskommen und muss vielzählige Funktionen beinhalten, um die Tests prozessieren zu können. Dazu gehören z. B. exaktes Dosieren weniger Mikroliter, Mischen, Verdünnen, Vorinkubation und Inkubation.
Eine weitere, essentielle Voraussetzung für ein POCT-System sind akkurate Testergebnisse. Diese Ergebnisse sollen im Rahmen der Vorschriften von validierten Methoden liegen, wie z. B. die Vorgabe der FDA "Guidance for Industry on Bioanalytical Method Validation" oder der Richtlinie der Bundesärztekammer. Das bedeutet unter anderem die Einhaltung der Präzision und Genauigkeit unter vorgeschriebener Berechnung. Diese Grenzwerte sollen durch die Etablierung spezieller Methoden innerhalb der Mikroarrays erreicht werden, die das Testsignal korrigieren und so akkurat werden. Im Rahmen der Arbeit sollen so unterschiedliche Methoden getestet werden.

 

Severe sepsis has a high incidence and mortality. Over the last years sepsis has an creasing incidence having presently 51-95 new cases per 100 000 persons in ised countries. Therefore numbers of cases of death are still growing, although the latest numbers of mortality are 18 % being constantly decreasing for countries in Europe and USA. The point-of-care testing (POCT) takes advantage of on-site patient testing reducing the therapeutic-turn-around-time (TTAT), since the patient sample needs not be sent to a clinical laboratory. For sepsis a reduction of the TTAT is essential and could lead to a further reduction of the mortality rate.
This dissertation reports about the realization and integration of methods into a system fulfilling the important criteria for POCT. The requirements are low testing time, use of small sample volumes, compactness, cost efficiency, fluid handling, automation and a high sensitive detection technique. For this purpose a fluidic unit was developed and combined with an optical unit. The optical unit is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) by use of special waveguide biochips. The system reads out microarray based multi parameter immunofluorescence assays. This system is deeply characterised.
For diagnosis of sepsis and its severity the protein biomarkers C-reactive protein (CRP), interleukin 6 (IL-6), procalcitonin (PCT) and neopterin (NPT) are integrated in a multiparameter on-chip immunofluorescence assay. Several standard curves were generated by three-fold replicates in a standard serum substitute solution with 4 % human serum albumin and human plasma containing spiked standard analytes. PCT and IL-6 are carried out in a sandwich assay format whereas NPT and CRP are processed in a binding inhibition format. Both assay types are processed in parallel by the fluidic unit. The assay time for a single multi parameter assay could be reduced from three hours to 25 minutes. The protein chip is processed fully automated using 10 µL sample. To execute the two assay formats in parallel, a fluid handling method was developed performing dilution, mixing, pre-incubating and incubating processes. All fluidic and optical processes are executed automatically.
An additional important demand for POCT is the accuracy and precision of the measurements. For this purpose on-chip reference methods were developed, investigated and integrated in form of a reference reaction processed in parallel to the clinical assays. Three different reference methods were analysed by forming new standard curves. Especially one of the three methods was able to reduce spot-to-spot variances and chip-to-chip variances drastically.
The combination of the fields of activity in this dissertation is leading to an integrated system performing immunoassays for sepsis relevant markers accurate, fast and automated.

: http://publica.fraunhofer.de/documents/N-234133.html