Fraunhofer-Gesellschaft

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Vergleich zweier eukaryotischer Expressionssyteme in der Zelllinienentwicklung

 
: Dietrich, Jana
: Biselli, Manfred; Veith, Nathalie

Aachen, 2012, VIII, 94 pp.
Aachen, FH, Bachelor Thesis, 2012
German
Bachelor Thesis
Fraunhofer ITEM ()
pharmaceutical biotechnology; antibody

Abstract
In der medizinischen Diagnostik und Therapie haben rek. mAb´s eine große Bedeutung, so dass es wichtig ist Produktions- und Expressionssysteme zu ermitteln, die einen qualitativ hochwertigen AK in hohem Maßstab produzieren. Heutzutage werden rund 70 % aller rek. mAb´s mit Säugetierzellen, vor allem mit CHO-Zellen, hergestellt. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit die gebräuchlichsten Expressionssysteme, GS- und RMCE-System, für Säugetierzellen vergleichend untersucht.
Durch die Aufnahme des Stabilitätstestes, bei dem es innerhalb von zwei Wochen zum Silencing der AK-Expression kam, konnte gezeigt werden, dass die Verwendung der GS als Selektionssystem in CHO-K1-Zellen zu instabilen Zelllinien führt. Daraufhin wurde die MSX-Sensitivität von CHO-K1-Zellen untersucht, wobei belegt werden konnte, dass die Verwendung von 25 - 50 Mikrometer MSX zur Selektion positiver Zellen mit endogener GS nicht geeignet ist. Bei der transienten Überprüfung der GS-Plasmide erreichten andere Zelllinien, wie HEK 293T-Zellen, höhere Ausbeuten als CHO-K1-Zellen. Zudem wurde die RMCE-Technik in CHO-Zellen untersucht, wobei durch die lentivirale Integration der Taggingkassette eine stabile Expression des Markergens über zwei Monate hinweg gezeigt werden konnte. Der Kassettenaustausch wurde anschließend durch die Flp-Rekombinase katalysiert und führte zu einem effektiven Austausch. Es wurden jedoch weiterhin Genaktivitäten der eigentlich ausgetauschten Taggingkassette beobachtet. Ferner konnte gezeigt werden, dass es möglich ist das GS-System in einen Targetingvektor des RMCE zu integrieren und damit Zellen zu generieren, die ohne Glutamin im Medium wachsen können. Außerdem wurde der Ansatz zur Genkomplementierung durch die RMCE-Technik verfolgt. Dazu wurde das DHFR-Gen in zwei Sequenzabschnitte zerlegt und durch den Kassettenaustausch eine Komplementierung des split-DHFR-Gens erzielt. Dies führte zur Expression eines funktionalen Enzyms, da Hypoxanthin- und Thymidin-auxotrophe CHO-Mutanten nach dem Targeting befähigt waren in Medium ohne HT-Supplement zu wachsen.

: http://publica.fraunhofer.de/documents/N-225649.html