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Untersuchungen zur Entwicklung eines Kultivierungsmediums für eine humane Amniocyten-Zelllinie

 
: Müller, Janina
: Lang, Siegmund; Ziehr, Holger

Braunschweig, 2012, V, 104 pp.
Braunschweig, TU, Bachelor Thesis, 2012
German
Bachelor Thesis
Fraunhofer ITEM ()
pharmaceutical biotechnology

Abstract
Zunächst wurde das Standardmedium KM015 für die humane Amniocyten-Zelllinie optimiert. Dabei wurde versucht, die Batchphase eines Perfusionslaufes günstiger aber genauso effizient durch mehrere Medienvariationen des KM015 zu gestalten. Die Medien mit 80 % und 50 % Aminosäure- und Zuckerkonzentration erwiesen sich mit vergleichbaren Zelldichten und Produktkonzentrationen jedoch nur bis 200 h als Alternativen, welches für die initiale Batchphase völlig ausreicht. Mit der 80% Variante konnte eine maximale Zelldichte von 53,51x105 Zellen/mL erzielt werden. Die 50% Reduzierung lieferte 45,78x105 Zellen/mL. Sollte also die eigentliche Perfusion erst bei maximal 150-200 h starten, könnte sich der Ein-satz der beiden Alternativen lohnen. Bevor jedoch ein solch teurer und aufwändiger Perfusionsversuch gestartet wird, sollte zuvor der in diesem Rahmen durchgeführte zur Bestätigung der Ergebnisse wiederholt werden.
Mit dem zweiten Schüttelkolbenversuch wurde der erste Schritt für die Optimierung der Fed-Batch-Kultivierung mit KM015 durchgeführt. Offensichtlich sind die meisten Medienkomponenten in ausreichender Menge im Grundmedium enthalten, sodass ein Feed, welcher am ITEM nicht messbare Substanzen wie Vitamine enthält, überflüssig erscheint. Jedoch haben die CAP-Zellen bei längerer Kultvierung einen erhöhten Bedarf an den Aminosäuren Lysin, Glutamin, Serin und Tryptophan. Aus diesen vier Aminosäuren besteht somit die optimale Feedlösung mit einer Konzentration von 30 % bezogen auf das Grundmedium KM015. Auch die 15 %-Variante liefert ähnlich hohe Zelldichten, jedoch weniger Produkt.
Das Ergebnis wurde im 1L Reaktor verifiziert. Dabei fand jedoch nur die 15 %ige Feedlösung Verwendung, da zum Zeitpunkt der Durchführung die Produktivität nicht vorlagen und durch identisches Wachstum fälschlicherweise ähnliche Produktkonzentrationen angenommen wurden. Dennoch konnten im Reaktor sowohl im Batch als auch im Fed-Batch-Modus gute Ergebnisse erzielt werden. Die spezifische Produktrate des Fed-Batch Reaktors wurde zum Anfang der Kultivierung auf (2,36 10-3 ± 8,13 10-5)/105Zellen pro Tag gesteigert. Auch die Zellen im Reaktor der Fed-Batch Strategie sind mit 113,64x105 Zellen/mL höher als im ver-gleichbaren Kolben (96,73x105 Zellen/mL) gewachsen. Der andere Fed-Batch verhielt sich nur bis 187,43 Stunden vergleichbar, danach wurde aus unerfindlichen Gründen abrupt sehr stark Laktat bis zu einer Konzentration von 3,31 g/L gebildet. Dies führte zum Absinken des pH-Wertes und zur ständigen Zugabe von NaOH, sodass das Wachstum einbrach. Die Batchreaktoren liefen ebenfalls ähnlich zum Batchkolben, lieferten jedoch geringere Zelldichten und höhere Laktatwerte.
Vielversprechend könnte die Ausführung dieses Versuches mit der 30%igen Feedlösung sein, welche zu noch höheren Titern führen könnte. Interessant wäre es weiterhin, ob das Phänomen der plötzlichen und erhöhten Laktatproduktion erneut auftritt. Weiterführende Versuche, um einen optimalen Feed zu erhalten, könnten Untersuchungen darüber sein, inwieweit alle Aminosäuren oder nur einige in der Feedlösung gebraucht werden. Zusätzlich wäre es interessant das optimale Verhältnis der einzelnen Komponenten in der Feedlösung zueinander her-auszufinden. Auch die Auswirkungen der Änderungen der Feedlösung auf das Wachstum, die Antikörperkonzentration und -qualität, den pH-Wert und die Bildung von Laktat und Ammonium wären interessant. Möglich wäre auch ein Versuch, in welchem das Aufkonzentrieren der Feedlösung untersucht wird.

: http://publica.fraunhofer.de/documents/N-225544.html