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Etablierung pathway-spezifischer Genexpressionsanalysen am Beispiel der Wirkung von Paraquat auf humane Lungenepithelzellen

 
: Augustin, Christian
: Pfitzner, Reinhard; Niehof, Monika

Hannover, 2012, X, 45 pp.
Emden/Leer, Hochschule, Bachelor Thesis, 2012
German
Bachelor Thesis
Fraunhofer ITEM ()
biotechnology; gene expression; Paraquat; epithelial cell; lung

Abstract
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung von sogenannten "Pathway Arrays" (SABiosciences), mit denen die Expression einer Vielzahl von Genen parallel untersucht werden kann. Als Testsubstanz wurde das Pflanzengift Paraquat verwendet, das durch Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) seine toxische Wirkung entfaltet. ROS kann zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren fuhren, welche die Transkription von Genen mit Bedeutung in Entzündungsprozessen, Zellwachstum, Differenzierung oder Apoptose regulieren. Paraquat wird bevorzugt von alveolaren Lungenepithelzellen vom Typ II aufgenommen, daher wurden die Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit an der humanen Lungenepithelzelllinie A549 durchgeführt. Über Vitalitätsassays und ROS-Messung wurden Paraquatbedingungen bezüglich Konzentration und Behandlungszeitraum etabliert, die als Parameter für die Genexpressionsuntersuchungen eingesetzt wurden (2 mM, 24 h). Auf Grund der Wirkung von Paraquat auf Entzündungsprozesse wurde zur Etablierung ein Array für den NF?B-Signalweg eingesetzt (84 Gene). Dabei wurden circa 40% der untersuchten Gene signifikant reguliert. Eine Einteilung der Gene nach Funktionen ergab, dass, wie zu erwarten, eine Vielzahl Cytokine, die an Entzündungsprozessen beteiligt sind, reguliert wurden (z.B. IL8, IL1A, IL1R1, TNF, TLR4, CSF2). Zusatzlich konnte gezeigt werden, dass Paraquat diverse Transkriptionsfaktoren reguliert (z.B. EGR1, STAT1, JUN, FOS), die u. a. an der Regulation der Expression von Cytokinen beteiligt sein können. Zur Validierung der Expressionsergebnisse wurden 15% der Gene des Arrays ausgewählt (13 Gene, "up", "down" und "unregulated"). Die Expression dieser Gene konnte mittels Real-time RT-qPCR am Lightcycler (Roche) vollständig bestätigt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Etablierung der "Pathway-Arrays" erfolgreich war, da diese eine hohe Genauigkeit und Qualität lieferten. Ein großer Vorteil der Arrays gegenüber den Expressionsuntersuchungen der einzelnen Gene am Lightcycler liegt darin, dass sie erheblich weniger Zeit für die Versuche in Anspruch nehmen.

 

The aim of the present study was the establishment of "Pathway Arrays" (SABiosciences) with which the expression of a variety of genes can be assessed simultaneously. Paraquat, an herbicide, was used as test substance. It evolves its toxic effects by forming reactive oxygen species (ROS). ROS can lead to the activation of transcription factors, which regulate the transcription of genes relevant for inflammatory response, cell growth, differentiation or apoptosis. Paraquat is preferably accumulated in alveolar epithelial cells type II. Therefore, the human alveolar epithelial cell line A549 was used in this study. Paraquat conditions regarding concentration and treatment time used in the gene expression analysis studies (2 mM, 24h) were established via cell viability and ROS assays. Due to the effect of Paraquat on inflammatory response an array for the NF?B-Signaling-Pathway was used for establishment (84 genes). About 40% of the tested genes were significantly regulated. A classification of the genes into functions showed that, as expected, a great number of cytokines, being involved in inflammatory response, were regulated (e.g. IL8, IL1A, IL1R1, TNF, TLR4, CSF2). Furthermore, it could be shown that Paraquat regulate miscellaneous transcription factors (e.g. EGR1, STAT1, JUN, FOS), which could take part in the regulation of cytokine expression. To validate the array results 15% of the array genes (13 genes, "up", "down" and "unregulated") were chosen. The expression of these genes was completely confirmed via real-time RT-qPCR with the Lightcycler (Roche). The results of this study show that the establishment of the "Pathway Arrays" was successful. The arrays yield a high precision and quality. Additionally, the arrays have a major advantage compared to the analysis of individual genes with the Lightcycler, because they take much less time to perform.

: http://publica.fraunhofer.de/documents/N-224910.html