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2009
Diploma Thesis
Titel
Etablierung einer spezifischen Diagnostik für Sensiblisierungen gegenüber Schimmelpilzallergenen
Abstract
Die Zahl der Schimmelpilzallergien hat in den letzten Jahrzehnten drastisch zugenommen. A. versicolor gehört zu den am häufigsten in Innenräumen auftretenden Schimmelpilzen und steht in Verdacht, allergische Atemwegserkrankungen beim Menschen hervorzurufen. Die vorliegende Diplomarbeit hatte zum Ziel, ein geeignetes immunologisches Verfahren zu entwickeln, um eine klinische Diagnostik auf Sensibilisierungen gegenüber dem Schimmelpilzallergen Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) aus Aspergillus versicolor zu ermöglichen. Es konnte folgender nichtkompetitiver indirekter ELISA entwickelt und optimiert werden: Die Mikrotiterplatte (LUMITRAC 200, Greiner bio one) wurde mit 10 mg/ml rekombinantem GAPDH-Protein in 0,05M Carbonatpuffer (pH 9,6) in einem Volumen von 100 ml pro Kavität über Nacht bei 4°C beschichtet. Es folgte ein dreimaliges Waschen der Kavitäten mit PBS, dem 0,05 % Tween 20 (PBST) zugesetzt war. Anschließend wurde die Mikrotiterplatte eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) mit SuperBlock (Pierce) in TBS geblockt. Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurden die 1:10-verdünnten Serumproben zugegeben (100 ml/Kavität) und für eine Stunde bei RT inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationsphase erfolgte ein dreifacher Waschschritt mit PBST bevor der vorbehandelte Sekundärantikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase, zugesetzt wurde. Für die Vorbehandlung wurden die drei verschiedenen Sekundärantikörper (Mouse anti-Human IgE, AbD Serotec; Mouse anti-Human IgG1, Mouse anti-Human IgG4, Invitrogen) jeweils entsprechend den Herstellerangaben in PBST verdünnt und mit 20 mg/ml rekobinantem Protein über Nacht bei 4°C im Rotator bei 2 rpm inkubiert. Die Sekundärinkubation erfolgte mit 100 ml vorbehandelter Antikörperlösung pro Kavität zwei Stunden bei RT. Nach erneutem fünfmaligem Waschen der Kavitäten wurden 100 ml/Kavität Substrat (LumiGLO, KPL) zugesetzt. Anschließend wurde die Chemilumineszenz nach fünf Minuten Inkubationszeit mit dem Tecan-ELISA-Reader Safire 2 gemessen. Die spezifische labordiagnostische Bestimmung von A. versicolor-spezifischen IgE- und IgG-Antikörpern ist nicht nur ein Fortschritt in der Allergiediagnostik, sondern auch eine wichtige Vorraussetzung für den Einsatz der gereinigten Allergene in therapeutischen Maßnahmen wie der Hyposensibilisierung.
ThesisNote
Jena, FH, Dipl.-Arb., 2009
Verlagsort
Leipzig